本文關(guān)鍵詞：大鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R的PET顯像

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【摘要】：目的:缺血性心臟病每年在全球范圍內(nèi)造成700萬的死亡,占疾病致死人數(shù)的12.9%,是首要的死因。當(dāng)發(fā)生心肌梗死,使病變血管再通是促進(jìn)缺血心肌存活的必要前提,但再通的血流也會(huì)帶來再灌注損傷。動(dòng)物試驗(yàn)和臨床研究證實(shí)缺血后的再灌注誘導(dǎo)了致死性心肌細(xì)胞損傷,而細(xì)胞損傷誘發(fā)的心肌梗死占總?cè)毖T導(dǎo)的心肌梗死50%,25%的PCI治療患者發(fā)生更大的心肌梗死,因此防治再灌注損傷已成為心血管專家面臨的巨大挑戰(zhàn)。在這個(gè)背景下,近年來發(fā)現(xiàn)的腸促激素——胰高血糖素樣肽-1(GLP-1)展現(xiàn)出良好的應(yīng)用前景。作為一類新型的治療糖尿病的藥物,GLP-1在動(dòng)物模型和早期臨床實(shí)驗(yàn)中均表現(xiàn)出潛在的心血管保護(hù)效應(yīng),也因此成為缺血再灌注損傷研究的新熱點(diǎn)。GLP-1由胰高血糖素原前體經(jīng)轉(zhuǎn)錄后修飾而成,由腸L細(xì)胞在進(jìn)食刺激下分泌。GLP-1的受體屬于G蛋白偶聯(lián)受體家族,GLP-1通過GLP-1R引發(fā)的胞內(nèi)信號通路發(fā)揮作用。研究者在人體許多組織中找到GLP-1R,同時(shí)發(fā)現(xiàn)了GLP-1對許多不同組織發(fā)揮生理作用。其中,GLP-1對心血管系統(tǒng)的保護(hù)作用受到廣泛關(guān)注。在心臟,GLP-1通過激動(dòng)GLP-1R激活c AMP/PI-3K通路發(fā)揮抗凋亡作用,因而在缺血再灌注損傷的心肌,給予GLP-1能顯著減少梗死面積。再灌注早期及時(shí)識別GLP-1R靶點(diǎn),并給予有效調(diào)控,將對臨床再灌注損傷治療起到事半功倍的效果,但目前傳統(tǒng)的檢測方法無法在活體水平對其識別、指導(dǎo)治療。本課題組在國際上首次合成了GLP-1R探針18F-FBEM-EM3106B,預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該探針可對缺血心肌GLP-1R進(jìn)行活體成像,但該探針合成復(fù)雜、耗時(shí)較長同時(shí)需要專業(yè)放化人員合成,不適合普通推廣。因此本課題組擬在心臟中首次利用一步法合成的新型探針18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4,應(yīng)用micro PET對大鼠心臟GLP-1R進(jìn)行高特異、高敏感、無創(chuàng)的多�；铙w成像,并利用分子生物學(xué)方法對缺血心肌GLP-1R表達(dá)進(jìn)行驗(yàn)證,揭示大鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R的表達(dá)變化,實(shí)現(xiàn)活體對靶標(biāo)的早期識別。利用核素探針可視化、定量靶標(biāo)的變化,不僅為再灌注損傷內(nèi)在受體活體水平早期識別提供新手段,也為再灌注損傷藥物干預(yù)提供新靶點(diǎn)。方法:1.大鼠心肌缺血再灌注模型的制備:選取200-250g雄性SD大鼠為實(shí)驗(yàn)對象,分為假手術(shù)組、再灌注8小時(shí)組、再灌注1天組、再灌注3天組、再灌注7天組,腹腔注射0.3%戊巴比妥鈉麻醉,麻醉成功后行氣管插管,機(jī)械通氣,而后開胸,于左心耳下靠肺動(dòng)脈圓錐處結(jié)扎冠狀動(dòng)脈左前降支,深度1-2mm寬度2-3mm,缺血持續(xù)30分鐘后松開結(jié)扎線。假手術(shù)組將線穿過冠狀動(dòng)脈左前將至下心肌組織而不結(jié)扎,同樣在30分鐘后撤線。2.大鼠心肌缺血再灌注模型的驗(yàn)證:大鼠在缺血前連接心電向量示波設(shè)備,在術(shù)中動(dòng)態(tài)觀察心電向量的變化,記錄。缺血再灌注術(shù)后1天,以小動(dòng)物超聲觀察大鼠左室搏動(dòng)情況,測量左室收縮末容積、左室舒張末容積,計(jì)算出射血分?jǐn)?shù),評價(jià)左心功能;同日,行大鼠心肌18F-FDG的PET顯像,觀察大鼠心肌攝取葡萄糖能力,評價(jià)心肌活力及殘存心肌面積。3.核素示蹤劑18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的合成:按照以往合成方法,在藥物NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4中引入18F,按照一步合成法操作,而后于分析性HPLC中進(jìn)行色譜分析,定位其峰值,再于制備型HPLC中純化產(chǎn)物,得到目標(biāo)核素示蹤劑。4.大鼠心臟18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET活體顯像:各組大鼠在對應(yīng)的時(shí)間點(diǎn)進(jìn)行心臟18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET顯像,由尾靜脈注射核素示蹤劑,1小時(shí)后行PET靜態(tài)掃描,持續(xù)10分鐘,以二維有序子集最大期望算法重建圖像。該探針特異性檢驗(yàn)應(yīng)用抑制試驗(yàn)即取對照組靜脈注射無核素標(biāo)記的Exendin-4(8mg/kg),經(jīng)10分鐘后再注射18F-Al F-NOTA-MALCys40-Exendin-4,而后再行心臟PET顯像。所有PET顯像實(shí)驗(yàn)均記錄注射前放射藥物放射劑量、注射時(shí)間、注射后針管內(nèi)殘余放射劑量、掃描開始時(shí)間以及掃描結(jié)束時(shí)間,計(jì)算每克組織攝取的放射性劑量占注入總放射性劑量的百分比(%ID/g)5.GLP-1R定位雙探針成像:為進(jìn)一步確證該探針高吸收率部位即為缺血損失區(qū),我們應(yīng)用18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4和18F-FDG雙探針成像,即取再灌注1天組大鼠,在18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4的PET顯像完成后靜脈注射18F-FDG,再經(jīng)過1小時(shí)行心肌的PET顯像,所得的兩個(gè)結(jié)果進(jìn)行圖像融合。6.分子水平體外檢測大鼠心肌GLP-1R表達(dá)變化:大鼠在PET顯像結(jié)束后處死,取缺血部位心肌組織,分別留作蛋白免疫印跡和免疫組化染色。以蛋白免疫印跡法半定量檢測缺血部位心肌組織的GLP-1R水平,以免疫組化染色法直觀顯示大鼠心肌組織里GLP-1R表達(dá)的疏密。結(jié)果:1.大鼠心肌缺血再灌注模型建立成功:術(shù)中心電向量示波監(jiān)測顯示,結(jié)扎大鼠冠狀動(dòng)脈左前降支立即引起心電向量圖ST段抬高,并在接下來的30分鐘內(nèi)維持早高水平,松開結(jié)扎線使心電向量圖ST段有所回落,但仍高于術(shù)前水平;術(shù)后1天大鼠心臟超聲檢查可見大鼠心室前壁搏動(dòng)幅度明顯降低,測量左室收縮末期容積、左室舒張末期容積后計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù),再灌注組術(shù)后射血分?jǐn)?shù)(70.4±0.50)%較假手術(shù)組(87.4±1.03)%明顯下降;術(shù)后1天大鼠心臟18F-FDG的PET掃描,結(jié)果顯示心室前壁放射缺損,表明心室前壁心肌組織低代謝,存活心肌少。2.18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4對大鼠心臟GLP-1R的示蹤表現(xiàn):從矢狀面、冠狀面、橫切面三個(gè)面綜合觀察可見,18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4在大鼠的肺、腎、膀胱、胰腺顯影最明顯,正常心臟組織由于GLP-1R表達(dá)水平不高,顯影不清晰。而在缺血再灌注后的心臟,局部18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4顯影增強(qiáng),與周圍組織形成對比,提示心臟缺血后GLP-1R表達(dá)的上調(diào)。阻斷實(shí)驗(yàn)大鼠心臟顯影明顯減弱,確證了該探針的高特異性。GLP-1R雙探針成像結(jié)果發(fā)現(xiàn)心肌缺血部位表現(xiàn)為18F-FDG吸收缺損,而18F-Al F-NOTA-MAL-Cys40-Exendin-4心肌高吸收部位與之重疊,證實(shí)GLP-1R高表達(dá)在缺血部位,驗(yàn)證該探針的高敏感性。3.大鼠心肌缺血再灌注后GLP-1R的表達(dá)變化:各組PET顯像的結(jié)果經(jīng)過%ID/g校正后,可見心肌缺血處放射增強(qiáng),與周圍組織對比明顯,其中再灌注8小時(shí)組放射活性最強(qiáng),自再灌注1天組始逐漸減弱,至再灌注7天組已與對照組相差無幾。體外結(jié)果表達(dá)變化趨勢和PTE結(jié)果變化趨勢一致,共同提示大鼠心肌GLP-1R在缺血再灌注后的表達(dá)變化呈現(xiàn)先上升后回落的趨勢,在再灌注8小時(shí)達(dá)到高峰,再灌注7天恢復(fù)到近正常水平。結(jié)論:1.核素示蹤劑F-Al F-NOTA-MAL-Cys-Exendin-4以一步法合成,快速高效,能準(zhǔn)確敏感的定位大鼠心肌缺血后GLP-1R受體的表達(dá)位點(diǎn),因而其在幫助發(fā)現(xiàn)心肌缺血再灌注新靶點(diǎn),監(jiān)測其變化,為臨床指導(dǎo)藥物干預(yù)及藥物發(fā)展具有良好的應(yīng)用前景。2.缺血再灌注損傷能激活大鼠心肌缺血部位GLP-1R的表達(dá),其總體趨勢是先上升后回落,在再灌注8小時(shí)達(dá)到頂峰,至再灌注7天恢復(fù)至近正常水平。
【關(guān)鍵詞】：缺血性心臟病 缺血再灌注損傷 GLP-1R exendin-4
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R542.2
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 前言15-17
• 文獻(xiàn)回顧17-29
• 第一部分 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 探針的合成及色譜分析29-34
• 1 材料29-30
• 2 方法30-31
• 2.1 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 探針的合成30
• 2.2 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 探針的色譜分析及純化制備30-31
• 3 結(jié)果31-33
• 3.1 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 分子式31-32
• 3.2 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 色譜分析32-33
• 4 討論33-34
• 第二部分 心肌缺血再灌注動(dòng)物模型的制備與驗(yàn)證34-41
• 1 材料34-35
• 2 方法35-36
• 2.1 大鼠缺血再灌注模型的制備35
• 2.2 缺血再灌注模型成功建立的驗(yàn)證35-36
• 2.3 數(shù)據(jù)分析36
• 3 結(jié)果36-38
• 3.1 模型制備過程中心電向量示波圖變化36
• 3.2 缺血再灌注后超聲心動(dòng)變化36-37
• 3.3 缺血再灌注術(shù)后1天心臟~(18)F-FDG的PET顯像37-38
• 4 討論38-41
• 第三部分 大鼠缺血再灌注后GLP-1R的PET活體顯像41-48
• 1 材料41-42
• 2 方法42-43
• 2.1 實(shí)驗(yàn)分組42
• 2.2 缺血再灌注模型制備42
• 2.3 ~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 藥品合成42
• 2.4 大鼠GLP-1R的PET顯像42
• 2.5 ~(18)F-FDG和~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 雙探針定位成像42-43
• 2.6 大鼠心臟攝取~(18)F-Al F-NOTA-MAL-Cys(40)-Exendin-4 的半定量分析43
• 2.7 數(shù)據(jù)分析43
• 3 結(jié)果43-46
• 3.1 缺血再灌注后大鼠心臟GLP-1R表達(dá)上調(diào)位點(diǎn)的定位43-44
• 3.2 大鼠缺血再灌注后GLP-1R的表達(dá)變化44-46
• 4 討論46-48
• 第四部分 分子水平檢測大鼠缺血再灌注后GLP-1R體外表達(dá)變化48-57
• 1 材料48-50
• 1.1 試劑48-49
• 1.2 試劑的配制49-50
• 1.3 儀器設(shè)備50
• 2 方法50-53
• 2.1 蛋白免疫印跡50-52
• 2.2 免疫組化染色52-53
• 2.3 數(shù)據(jù)分析53
• 3 結(jié)果53-55
• 3.1 蛋白免疫印跡53-54
• 3.2 免疫組化染色54-55
• 4 討論55-57
• 小結(jié)57-59
• 參考文獻(xiàn)59-70
• 個(gè)人簡歷和研究成果70-71
• 致謝71

【二級參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 朱啟偉;王浩;張今堯;葉平;駱雷鳴;;吡格列酮對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞損傷的保護(hù)作用及對蛋白激酶C表達(dá)的影響[J];南方醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào);2011年11期

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本文編號：1126588