本文關(guān)鍵詞：二硫鍵異構(gòu)酶ERp72在靜脈血栓形成中的作用及其機制的初步研究

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【摘要】：研究目的靜脈血栓形成(Venous Thrombosis)導(dǎo)致的靜脈血栓栓塞癥(Venous Thrombus Embolism,VTE)是一種嚴重地威脅人類生命健康的疾病,目前沒有理想的治療藥物,主要原因之一是靜脈血栓的發(fā)生和發(fā)展機制仍不清楚。近幾年,蛋白二硫鍵異構(gòu)酶(Protein Disulfide Isomerase,PDI)家族在調(diào)控血栓形成中的作用日益受到關(guān)注,PDI家族的不同成員分別在內(nèi)皮細胞活化,血小板聚集,白細胞募集,凝血系統(tǒng)激活以及纖維蛋白沉積等過程中發(fā)揮著重要作用,這為認識靜脈血栓形成過程提供了新的研究思路。ERp72是PDI家族的重要成員,它含有三個PDI家族高度保守的同源序列,廣泛表達于血小板,白細胞和內(nèi)皮細胞。本研究建立了ERp72組織特異性敲除小鼠,并制備了重組ERp72蛋白和抑制型抗ERp72單克隆抗體,通過觀察ERp72的缺陷和活性抑制在小鼠靜脈血栓模型中的表型,認識ERp72在靜脈血栓形成中的作用,并初步探討其作用機制。研究方法1.構(gòu)建ERp72-loxp(ERp72fl/fl)小鼠,將ERp72fl/fl小鼠和Pf4-cre、Tie2-cre小鼠交配,獲得Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠(血小板ERp72特異性敲除小鼠)和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠(內(nèi)皮及造血系ERp72特異性敲除小鼠)。通過基因組PCR鑒定小鼠基因型;通過Western blot鑒定小鼠血小板、白細胞及內(nèi)皮細胞中ERp72表達水平。2.獲取Tie2-cre/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其對照小鼠全血,進行血細胞計數(shù)。分離Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠及對照小鼠血漿,檢測血漿凝血酶原時間(Prothrombin Time,PT)和活化部分凝血活酶時間(Activated Partial Thromboplastin Time,APTT)。3.使用Tie2-cre/ERp72fl/fl和Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠及其對照小鼠,建立小鼠下腔靜脈狹窄血栓模型,48小時后,取下腔靜脈血栓稱重并統(tǒng)計。使用C57BL/6小鼠建立小鼠下腔靜脈狹窄模型,并從尾靜脈注射250?g重組無酶活性ERp72蛋白(erp72oo-oo-oo)或等體積對照溶液,48小時后,取下腔靜脈血栓稱重并統(tǒng)計。4.將tie2-cre/erp72fl/fl小鼠及對照小鼠下腔靜脈狹窄6小時后,從狹窄處近心端采血400?l,應(yīng)用elisa檢測血漿血管性血友病因子(vonwillebrandfactor,vwf)水平。5.從pf4-cre/erp72fl/fl小鼠及對照小鼠全血中分離血小板,使用thrombin或convulxin刺激,檢測血小板聚集功能。6.將人外周血單個核細胞(peripheralbloodmonocuclearcell,pbmc)分別與erp72單克隆抗體或同型對照igg預(yù)孵育,100ng/ml脂多糖(lps)刺激4小時上調(diào)組織因子(tissuefactor,tf)表達,應(yīng)用凝血酶生成分析(thrombingenerationassay,tga)檢測兩組pbmc的凝血酶生成能力。使用負篩選方法分選tie2-cre/erp72fl/fl小鼠及對照小鼠骨髓單核細胞,100ng/mllps刺激4小時后,流式檢測tf表達水平。7.將重組野生型erp72蛋白(erp72ss-ss-ss)與凝血因子fxii(fxii)37℃孵育1小時,加巰基標記劑mbp室溫孵育15分鐘,通過非還原條件sds-page電泳和免疫印跡,檢測fxii自由巰基變化。實驗結(jié)果1.pcr結(jié)果表明erp72fl/fl小鼠的erp72基因成功插入loxp位點,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠和tie2-cre/erp72fl/fl小鼠基因組分別成功融合pf4-cre和tie2-cre位點;western結(jié)果顯示,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠和tie2-cre/erp72fl/fl兩種敲除小鼠血小板erp72均表達缺失,tie2-cre/erp72fl/fl小鼠白細胞和內(nèi)皮細胞erp72表達缺失,所有這些erp72敲除細胞pdi,erp57等同源蛋白均表達正常。2.兩種基因敲除小鼠的全血細胞計數(shù)與野生型小鼠相比均無差異;tie2-cre/erp72fl/fl小鼠血漿凝血酶原時間pt和活化部分凝血活酶時間aptt正常,說明erp72不參與骨髓造血功能和凝血蛋白合成。3.在小鼠下腔靜脈狹窄血栓模型中,與對照野生型小鼠組相比,pf4-cre/erp72fl/fl小鼠下腔靜脈中形成的血栓重量沒有明顯差異[20.58±2.20?g(n=8)vs16.97±1.42?g(n=12),p=0.1648],而tie2-cre/erp72fl/fl小鼠下腔靜脈中形成的血栓明顯減小[30.08±3.02?g(n=8)vs16.04±3.03?g(n=7),p=0.0062]。與尾靜脈注射對照溶液的小鼠相比,注射重組erp72無酶活蛋白erp72oo-oo-oo的小鼠下腔靜脈中形成的血栓明顯減小[23.84±2.97?g(n=8)vs 12.04±2.32?g(n=8),P=0.0074]。4.在未干預(yù)情況下,ERp72fl/fl小鼠和Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠血漿vWF含量沒有明顯差異[95.30±11.66ng/ml(n=4)vs 91.80±15.46ng/ml(n=4),P=0.8648];下腔靜脈狹窄6小時后,兩組血漿vWF含量均有增加,但敲除小鼠血漿vWF含量明顯低于對照組小鼠[156.9±3.42ng/ml(n=5)vs 120.2±10.32ng/ml(n=5),P=0.0188]。5.與對照小鼠血小板相比,使用thrombin或convulxin刺激的Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠血小板聚集功能明顯減弱。6.與對照IgG相比,抗ERp72單克隆抗體處理的PBMC受LPS刺激后,凝血酶生成峰值明顯降低[77.27±2.41nM(n=3)vs 52.43±3.87nM(n=3),P=0.0055]。經(jīng)過LPS刺激后,與ERp72fl/fl小鼠骨髓單核細胞相比,Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠骨髓單核細胞表面TF表達明顯減少。7.自由巰基標記實驗結(jié)果顯示,重組野生型ERp72蛋白(ERp72ss-ss-ss)能顯著增加FXII自由巰基水平。結(jié)論1.內(nèi)皮及造血系ERp72表達缺失顯著性抑制下腔靜脈血栓形成。2.ERp72通過調(diào)控vWF釋放,血小板聚集,單核細胞促凝活性以及FXII氧化還原狀態(tài)等方面影響靜脈血栓形成。
【關(guān)鍵詞】：靜脈血栓形成 蛋白二硫鍵異構(gòu)酶家族 二硫鍵異構(gòu)酶ERp72 小鼠下腔靜脈狹窄模型 凝血酶生成 自由巰基標記
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R543.6
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-12
• 引言12-15
• 材料與方法15-26
• 1. 實驗材料15-19
• 2. 實驗方法19-26
• 實驗結(jié)果26-44
• 1. ERp72-loxp小鼠的構(gòu)建26
• 2. Pf4-cre/ERp72fl/fl小鼠模型的構(gòu)建和鑒定26-29
• 3. 血小板ERp72的缺失不足以減弱下腔靜脈狹窄引起的靜脈血栓形成29-30
• 4. Tie2-cre/ERp72fl/fl小鼠模型的構(gòu)建和鑒定30-34
• 5. 內(nèi)皮及造血系ERp72缺陷減弱下腔靜脈狹窄引起的靜脈血栓形成34
• 6. 重組無酶活ERp72蛋白的制備與鑒定34-36
• 7. 重組無活性ERp72蛋白抑制下腔靜脈狹窄引起的靜脈血栓形成36-37
• 8. ERp72的缺失減弱vWF的釋放37-38
• 9. ERp72的缺失減弱血小板聚集功能38-39
• 10. ERp72上調(diào)單個核細胞的促凝活性39-42
• 11.重組ERp72蛋白催化FXII的還原反應(yīng)42-44
• 討論44-46
• 結(jié)論46-47
• 參考文獻47-51
• 綜述 靜脈血栓形成機制的研究進展51-64
• 綜述參考文獻57-64
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文及會議摘要64-65
• 英文縮略詞65-66
• 致謝66-67

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