本文關鍵詞：聚腺苷二磷酸核糖聚合酶1在糖尿病心肌病中的作用及機制研究

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【摘要】：背景糖尿病是一種慢性,漸進性的代謝性疾病,其主要特征是胰島素缺乏和/或抵抗,導致血漿葡萄糖水平的升高,并且確實是21世紀人類健康的一大威脅,由于發(fā)病率的上升,其狀況令人擔憂,在過去二十年里,吸引了相當多的關注。糖尿病心肌病(DCM)是糖尿病患者心功能不全且沒有冠狀動脈硬化和高血壓因素的影響,它也是人類健康的一大威脅,也是亟待解決的臨床問題。根據本課題組之前的研究結果,高血糖能夠誘導大鼠心肌細胞凋亡,因此本實驗使用葡萄糖刺激大鼠心肌細胞,構建高血糖細胞模型,高糖刺激是否引起細胞氧化應激和DNA損傷,并且影響PARP-1表達和活性。PARP-1在高糖導致的炎癥反應和凋亡信號通路中扮演著什么樣的作用。PARP-1在氧化應激和DNA損傷中扮演者重要的角色。本實驗對PARP-1進行干預,以期闡明PARP-1在糖尿病心肌病中的潛在作用機制以及找到治療糖尿病心肌病的可行的治療方法。目的構建小鼠糖尿病心肌病疾病模型,研究PARP-1在糖尿病心肌病中的潛在作用機制,同時構建心肌細胞高血糖模型,進一步研究PARP-1在心肌細胞凋亡中的具體調控機制。方法小鼠糖尿病心肌病建模,20只10周齡雄性C57BL/6野生型小鼠和20只10周齡雄性PARP-1基因敲除小鼠(美國杰克森實驗室),模型組小鼠給予腹腔注射鏈脲佐菌素(STZ),劑量為50mg/kg,對照組小鼠腹腔注射等體積的檸檬酸鹽緩沖液,連續(xù)注射5天。從小鼠尾靜取少量血液,使用羅氏血糖儀檢測小鼠血糖變化,如果小鼠隨機血糖濃度16.7 mmol/l,則認為小鼠糖尿病模型建模成功。老鼠被飼養(yǎng)在無病原微生物的動物房并且確保有足夠的食物和水。用瓊脂糖凝膠PCR鑒定PARP-1敲基因小鼠的基因型。老鼠取材前進行超聲心動圖檢測,心臟直徑和功能用加拿大小動物成像儀檢測。檢測左心室射血分數(shù),縮短分數(shù),E/A峰(二尖瓣血流速度),左心室舒張末期內徑。所有的測量必須在統(tǒng)一觀測條件下的5個心動周期。尾靜脈測量小鼠心率,收縮壓和舒張壓。之后收集老鼠心肌標本,用Western Bolt and RT-PCR檢測基因和蛋白表達情況,HE染色和免疫組化觀察心臟形態(tài)學變化。培養(yǎng)細胞并造高血糖心肌細胞模型,PARP-1干預之后用Western Blot and Realtime-PCR檢測心肌細胞相關炎癥因子和凋亡因子變化,闡明PARP-1在糖尿病心肌病中的潛在作用機制。結果(1)高糖通過誘導DNA損傷增加了PARP-1的活性和表達。(2)PARP-1抑制劑在體外實驗中減輕了高糖引起的炎癥因子上調。(3)PARP-1抑制劑減輕了高糖誘導的細胞凋亡。(4)PARP-1抑制劑在體外實驗中增加了IGF-1R/Akt的磷酸化水平。(5)PARP-1缺失恢復了糖尿病小鼠的心功能并且減輕了高糖血癥引起的心肌重塑。(6)高糖血癥增加了硝基酪氨酸的水平并且增加了PARP-1的活性和表達。結論1、在體外,高糖刺激增加了氧化應激并且增加了高糖誘導的DNA損傷引起的PARP-1的活性和表達。PARP-1干擾顯著地減少了高糖引起的炎癥因子表達,包括TNF-α,IL-1β,IL-6,ICAM-1和iNOS。同時PARP-1干擾通過下調乳溝半胱天冬酶和激活IGF-1R/Akt信號通路減輕了心肌細胞凋亡。2、在體內,高糖血癥增加了硝基酪氨酸的表達和PARP-1的活性和表達。與正常小鼠相比,PARP-1缺失顯著地減少了高糖血癥引起的細胞凋亡和炎癥反應,并改善了心肌的組織學異常和心功能。
【關鍵詞】：糖尿病心肌病 PARP-1 高糖血癥 炎癥反應 凋亡
【學位授予單位】：河南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R587.2;R542.2
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 縮略詞表11-13
• 引言13-15
• 1 前言15-17
• 2 材料、儀器與試劑17-23
• 2.1 材料與試劑17-18
• 2.2 儀器18-20
• 2.3 部分溶劑配制方法20-23
• 3 實驗方法23-33
• 3.1 動物模型建立23
• 3.2 動物模型指標檢測23-25
• 3.3 細胞培養(yǎng)與干預25-27
• 3.4 總RNA提取27
• 3.5 引物設計27
• 3.6 實時定量PCR檢測27-28
• 3.7 小鼠基因型的鑒定28-29
• 3.8 彗星實驗29
• 3.9 ELISA29
• 3.10 Western Blot蛋白凝膠電泳29-31
• 3.11 流式細胞術31
• 3.12 統(tǒng)計學分析31-33
• 4 實驗結果33-43
• 4.1 動物模型的成功構建33-34
• 4.1.1 小鼠基因型的結果鑒定33
• 4.1.2 各組小鼠一般情況33
• 4.1.3 小鼠的通用指標檢測33-34
• 4.2 形態(tài)學觀察及部分基因檢測34-38
• 4.2.1 小鼠心肌HE染色34-35
• 4.2.2 小鼠心動超聲結果35-36
• 4.2.3 小鼠心肌凋亡相關指標檢測36-37
• 4.2.4 小鼠心肌炎癥反應相關指標檢測37-38
• 4.3 分子學實驗檢測38-43
• 4.3.1 氧化應激以及DNA損傷檢測38-39
• 4.3.2 細胞炎癥因子表達檢測39-40
• 4.3.3 流式細胞術檢測細胞凋亡40-41
• 4.3.4 信號通路蛋白檢測41-43
• 討論43-45
• 結論45-47
• 參考文獻47-50
• 綜述 糖尿病心肌病的研究進展50-59
• 參考文獻55-59
• 致謝59-61
• 在讀期間參加的學術會議及研究成果61-62

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本文編號：1074721