發(fā)布時間：2017-10-21 11:01

  本文關(guān)鍵詞：脂氧素A4通過增強(qiáng)LXRα途徑上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)

  更多相關(guān)文章： 脂氧素A4 ABCA1 肝X受體α 膽固醇流出

【摘要】：研究背景心血管疾病是危害人類健康的主要殺手和公共健康衛(wèi)生的巨大負(fù)擔(dān)。2015年中國心血管病報告表明心血管病占居民疾病死亡構(gòu)成的40%以上,為我國居民的首位死亡原因。動脈粥樣硬化(atherosclerosis, AS)是心血管疾病的共同發(fā)病基礎(chǔ),而高膽固醇血癥是導(dǎo)致動脈粥樣硬化的重要原因和風(fēng)險因素。目前對動脈粥樣硬化的治療主要是以他汀類等降脂藥為主,他汀類藥物通過抑制羥甲基戊二酰輔酶A還原酶的合成,從而阻斷膽固醇酯的合成,最終實現(xiàn)降低血脂防止AS的作用。但研究表明他汀類藥物只對20%-40%的動脈粥樣硬化患者起作用,并且可損傷肝臟以及導(dǎo)致橫紋肌溶解,因此,尋找新的和有效的防治動脈粥樣硬化的藥物是非常重要和緊迫的。已經(jīng)證實,過多的膽固醇在巨噬細(xì)胞中聚積形成泡沫細(xì)胞是AS發(fā)生的重要事件之一,而促進(jìn)膽固醇逆向轉(zhuǎn)運(reverse cholesterol transport, RCT)可增加膽固醇的代謝分解,降低血漿中膽固醇水平,從而保持體內(nèi)膽固醇平衡。ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運子A1(ATP binding cassette subfamily A member 1, ABCA1)是一種跨膜蛋白,在RCT中起著極其重要的作用。ABCA1主要介導(dǎo)細(xì)胞內(nèi)游離膽固醇和磷脂流出至細(xì)胞外,與載脂蛋白A1 (apolipoprotein A1, ApoA 1)結(jié)合生成高密度脂蛋白(high density lipoprotein, HDL),從而轉(zhuǎn)運至肝臟進(jìn)行分解代謝。因此ABCA1功能受損將會導(dǎo)致巨噬細(xì)胞內(nèi)膽固醇的外流受阻,促使巨噬細(xì)胞成為泡沫細(xì)胞,進(jìn)而浸潤血管壁形成脂質(zhì)斑塊,促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。研究表明,ABCA1基因突變可導(dǎo)致丹吉爾病(Tangier disease, TD)和家族性HDL缺乏癥(family HDL deficiency, FHD),表現(xiàn)為血漿中高密度脂蛋白膽固醇(high density lipoprotein cholesterol, HDL-C)水平降低以及膽固醇在組織細(xì)胞中聚積,從而早發(fā)冠心病。并且在一般人群中,ABCA1基因的幾個常見單核苷酸多肽性(single nucleotide polymorphism, SNP)也與血脂水平以及動脈粥樣硬化的嚴(yán)重程度密切相關(guān)。因此,促進(jìn)ABCA1蛋白的表達(dá)在降低血脂水平以及防治動脈粥樣硬化發(fā)生發(fā)展中起著非常重要的作用。肝X受體a (Liver X Receptor, LXRa)是配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一,主要在脂質(zhì)代謝活躍的組織中表達(dá)。LXRa能夠使低密度脂蛋白受體(low density lipoprotein receptor, LDLR)泛素化,導(dǎo)致LDLR降解,抑制細(xì)胞攝取富含低密度脂蛋白的膽固醇,從而維持膽固醇的平衡。并且XRa基因敲除小鼠高脂喂養(yǎng)后,由于失去處理膽固醇的能力,不能將過多的膽固醇進(jìn)行代謝,從而導(dǎo)致肝臟脂質(zhì)堆積明顯升高。這些體內(nèi)外實驗表明LXRa在維持膽固醇的平衡中具有重要的調(diào)控作用,表現(xiàn)出一定的抗動脈粥樣硬化的作用。此外,眾多研究表明,ABCA1基因是LXRa主要調(diào)控的靶基因之一。LXRa激動劑可誘導(dǎo)ABCA1的表達(dá),增加膽固醇向質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運,從而促進(jìn)ApoA1介導(dǎo)的膽固醇流出。因此LXRα--ABCA1通路很可能是調(diào)控膽固醇代謝以及抗動脈粥樣硬化藥物作用的一個重要靶點。脂氧素A4(Lipoxin A4, LXA4)是一類花生四烯酸代謝產(chǎn)物,經(jīng)脂氧化酶作用產(chǎn)生。因其能抑制炎癥相關(guān)基因的表達(dá),以及控制炎癥反應(yīng)的快速消退,被認(rèn)為是炎癥過程的“剎車信號”或“終止信號”。隨著對LXA4的深入研究,發(fā)現(xiàn)其除可作為炎癥調(diào)控的內(nèi)源性物質(zhì)之一外,在心血管疾病方面具有其他的生物學(xué)效應(yīng)。在人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞中,LXA4阻斷脂多糖(Lipopolysaccharides, LPS)對TNF-α表達(dá)的促進(jìn)作用,并通過抑制核因子kappa B(nuclear factor kappa B, NF-κB)途徑降低內(nèi)皮細(xì)胞的滲透性,從而保護(hù)內(nèi)皮細(xì)胞。阿司匹林誘生型LXA4能夠調(diào)控血管平滑肌細(xì)胞的表型轉(zhuǎn)換,阻斷血小板源性生長因子(plateletderived growth factor, PDGF)導(dǎo)致的血管平滑肌細(xì)胞的遷移和增殖。另有研究表明,阿司匹林可上調(diào)小鼠肝臟中脂氧素的濃度,并調(diào)節(jié)血漿中膽固醇代謝。這些研究提示LXA4可能與AS等心血管疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。然而,盡管LXA4與膽固醇水平有關(guān),但其對膽固醇的調(diào)控作用尚不清楚,其調(diào)控膽固醇的作用機(jī)制尚不清楚。本實驗采用與膽固醇代謝密切相關(guān)的THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞進(jìn)行研究,旨在觀察LXA4對THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞形成的影響。本研究發(fā)現(xiàn)在THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中,無論在基因水平還是蛋白水平,LXA4能濃度依賴性上調(diào)ABCA1的表達(dá)并促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇的流出,從而抑制泡沫細(xì)胞的形成,并且這一過程依賴于LXRα途徑。本次研究的結(jié)果為LXA4可能成為調(diào)控膽固醇代謝的藥物提供新的理論依據(jù)。研究方法1、細(xì)胞培養(yǎng)(1)THP-1細(xì)胞靜置培養(yǎng)：RPMI-1640培養(yǎng)基加入10%新生胎牛血清混勻,同時在培養(yǎng)液中加100μg/ml鏈霉素和100U/ml青霉素,放置37℃、5%CO2和濕度為100%的細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育。待細(xì)胞生長狀態(tài)良好時,取對數(shù)生長期細(xì)胞進(jìn)行實驗。(2)誘導(dǎo)分化：加入100ng/ml濃度的佛波酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate, PMA)刺激THP-1細(xì)胞,誘導(dǎo)成為巨噬細(xì)胞：再加入濃度為50μg/ml的Ox-LDL誘導(dǎo)其成為泡沫細(xì)胞。(3)細(xì)胞轉(zhuǎn)染：將細(xì)胞接種于6孔板中,待細(xì)胞融合度為80-90%時,按照lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染步驟將siRNA轉(zhuǎn)染到泡沫細(xì)胞,轉(zhuǎn)染48h后進(jìn)行后續(xù)實驗。2、氧化型低密度脂蛋白(oxidize low density lipoprotein, Ox-LDL)的準(zhǔn)備將200μg/ml低密度脂蛋白(low density lipoprotein, LDL)溶液加入含硫酸銅的磷酸鹽緩沖鹽水(phosphate buffer, PBS)中進(jìn)行氧化,37℃條件下孵育24小時。加入含200mM乙二胺四乙酸(ethylene dinitrilotetraacetic acid, EDTA)的PBS溶液終止其氧化反應(yīng)。然后在37℃下用PBS透析48小時以去除Cu2+,再用0.22μm孔徑的濾器過濾除菌,最后用BCA試劑定量蛋白濃度,并將濃度調(diào)至1g/L,4℃保存?zhèn)溆�。其�?新制備的Ox-LDL保存在含50 mM Tris-HCl,0.15 M NaCl and 2.0 mM EDTA的混合液中,其保存的pH為7.4,并在使用前十天之內(nèi)準(zhǔn)備。3、RNA提取和實時熒光定量PCR按照TRIzol試劑盒提取THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的總RNA,用紫外分光光度計(Thermo, NanoDrop2000)進(jìn)行RNA濃度的檢測。將1μg總RNA用TAKARA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒在普通PCR儀中反轉(zhuǎn)錄成20μl cDNA。在ABI 7500 FAST上進(jìn)行實時定量PCR來擴(kuò)增模板量,參照溶解曲線來分析PCR反應(yīng)的特異性,以GAPDH表達(dá)量為內(nèi)參并以AΔCt方法定量mRNA的相對表達(dá)量。4、免疫印跡(Western blot analyses)采用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白,采用BCA試劑檢測蛋白濃度；對蛋白提取物定量后向剩余的蛋白提取物中加入其五分之一體積的5×SDS,混勻并煮沸10分鐘,冷卻后置-20℃待用。8%瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白ABCA1以及10%瓊脂糖凝膠電泳分離目的蛋白LXRa,然后按說明書要求依次電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉以兔多克隆抗ABCA1、LXRa和β-actin一抗孵育過夜,洗滌孵育二抗再洗滌后,以化學(xué)發(fā)光法顯示條帶,檢測目的蛋白的相對表達(dá)量。5、轉(zhuǎn)染小分子RNATHP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞接種在6孔板中(2×106／孔),待細(xì)胞密度達(dá)到80%至90%時,用lipofectamine RNAiMAX轉(zhuǎn)染LXRa-siRNA和空載siRNA。孵育37℃,48h后,用Trizol提取總RNA用于mRNA檢測,用凱基蛋白提取試劑盒提取蛋白用于免疫印跡的檢測。6、高效液相色譜分析待細(xì)胞處理結(jié)束后,用加樣槍吸去舊培養(yǎng)基,用PBS清洗細(xì)胞3遍,然后加入200μ1的細(xì)胞裂解液,反復(fù)凍融3次,保證細(xì)胞裂解充分。采用BCA法檢測蛋白濃度,然后加入濃度為7.2%的三氯乙酸來沉淀蛋白,放置片刻后在普通離心機(jī)以800×g的轉(zhuǎn)速離心10min,吸取上清至新的EP管進(jìn)行膽固醇檢測,以豆甾醇為內(nèi)標(biāo)。其中取100μ1上清液來進(jìn)行總膽固醇的檢測,在這100μ1上清液加入200μl濃度為8.9mol/L的氫氧化鉀溶液來水解膽固醇酯,水解膽固醇酯后的樣品即為細(xì)胞內(nèi)總膽固醇檢測樣品。各樣品分別與內(nèi)標(biāo)液混勻,加入正已烷和無水乙醇進(jìn)行抽提,再用濃度為1.5mol/L的三氧化鉻進(jìn)行氧化衍生并真空干燥,最后加入100μ1乙晴-異丙醇(80：20)溶解樣品,上樣于高效液相色譜儀。采用C-18柱,柱溫4℃,流速1mL/min,250nm紫外光檢測,膽固醇以峰面積定量,內(nèi)標(biāo)校準(zhǔn)。7、膽固醇流出實驗待用LXA4或siRNA-LXRa處理細(xì)胞結(jié)束后,在含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液中加入0.2uCi/mL[3H]標(biāo)記的膽固醇并共同孵育細(xì)胞,待細(xì)胞長至85%時,棄培養(yǎng)液,用PBS洗滌細(xì)胞,再用含載脂蛋白A1(apolipoprotein A1,apoA1)而不含胎牛血清RPMI-1640的培養(yǎng)液孵育細(xì)胞。24h后,收集細(xì)胞培養(yǎng)液；并經(jīng)PBS洗滌細(xì)胞后用閃爍液裂解細(xì)胞,用閃爍計數(shù)法分別檢測培養(yǎng)液和細(xì)胞中的[3H]膽固醇,單位為CPM。膽固醇流出率用培養(yǎng)液中CPM除以總CPM(培養(yǎng)液CPM+細(xì)胞CPM),再乘以100%來表示。8、統(tǒng)計分析采用SPSS 13.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析,結(jié)果表示為：均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)。兩組間各基因mRNA相對表達(dá)量、各蛋白免疫印跡條帶相對灰度值的比較采用兩獨立樣本t檢驗；多組間比較采用單因素方差分析。每組實驗重復(fù)3次,統(tǒng)計結(jié)果以P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果1、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。動脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展是巨噬細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞相互作用導(dǎo)致的結(jié)果。已有研究表明LXA4能夠影響內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)和平滑肌細(xì)胞的增殖遷移,提示LXA4與動脈粥樣硬化的發(fā)生密切相關(guān)。巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞的形成是動脈粥樣硬化的主要病理過程之一,并且ABCA1是一個膜整合蛋白,在膽固醇代謝中起著重要的作用,因此我們首先探討LXA4是否影響THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。我們采用OnM, 1nM, 10nM和100nnM等不同濃度梯度的LXA4刺激THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞,分別采用熒光定量PCR和免疫印跡檢測各組細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。結(jié)果顯示LXA4在轉(zhuǎn)錄水平和轉(zhuǎn)錄后水平可濃度依賴性上調(diào)ABCA1的表達(dá)。2、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中LXRa的表達(dá)。LXRa是配體激活的核受體轉(zhuǎn)錄因子超家族成員之一,是個膽固醇代謝相關(guān)的重要分子,在維持膽固醇的平衡中具有重要的調(diào)控作用。為了進(jìn)一步觀察LXA4對膽固醇代謝的影響,我們接下來探討LXA4是否影響細(xì)胞中LXRa的表達(dá)。我們采用不同濃度OnM, 1nM,10nM和100nM的LXA4刺激THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞,實時熒光定量PCR和免疫印跡檢測各組細(xì)胞中LXRa的表達(dá)。結(jié)果顯示,無論在基因水平,還是在蛋白水平,LXA4可濃度依賴性上調(diào)LXRa的表達(dá)。3、LXRa途徑介導(dǎo)了LXA4對ABCAl的上調(diào)作用。上述結(jié)果表明LXA4能同時上調(diào)ABCA1和LXRa的表達(dá),并且眾多研究表明ABCA1是LXRa調(diào)控的主要靶基因之一,因此我們推測在THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中LXA4可能通過LXRa途徑上調(diào)ABCA1的表達(dá)。我們采用小分子RNA干擾技術(shù)敲減LXRa基因,結(jié)果顯示LXRa表達(dá)量減少了88%。LXRa siRNA處理細(xì)胞后,LXA4對ABCA1的上調(diào)作用被抑制,表明LXA4通過LXRa途徑上調(diào)ABCA1的表達(dá)。4、LXA4通過LXRa途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和降低膽固醇含量。ABCA1是一種整合膜蛋白,主要參與膽固醇的逆向轉(zhuǎn)運,它能夠作為通道促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出并與細(xì)胞外的ApoA1結(jié)合,從而將過量的膽固醇運輸至肝臟進(jìn)行代謝。上述結(jié)果表明LXA4可以上調(diào)ABCA1的表達(dá),因此我們接著觀察LXA4對細(xì)胞中膽固醇流出的影響。與對照組相比,LXA4能夠促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出：而干擾LXRa表達(dá)后,與對照組相比,LXA4處理對細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。同樣的,與對照組相比,LXA4能降低細(xì)胞內(nèi)總膽固醇、游離膽固醇和膽固醇酯的含量；而干擾LXRa表達(dá)后,與對照組相比較,LXA4處理對細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量影響差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義。結(jié)果表明LXA4通過LXRa途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。結(jié)論1、LXA4濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1表達(dá)。2、LXA4濃度依賴性上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中LXRa表達(dá)。3、LXA4通過LXRa途徑上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)。4、LXA4通過LXRa途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出和降低細(xì)胞內(nèi)膽固醇含量。
【關(guān)鍵詞】：脂氧素A4 ABCA1 肝X受體α 膽固醇流出
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-25
• 材料和方法25-43
• 1、實驗材料25-27
• 2、主要溶液的配制方法27-28
• 3、實驗方法28-43
• 實驗結(jié)果43-52
• 1、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中ABCA1的表達(dá)43-44
• 2、LXA4上調(diào)THP-1巨噬細(xì)胞源性泡沫細(xì)胞中LXRα的表達(dá)44-46
• 3、LXRa途徑介導(dǎo)了LXA4對ABCA1的上調(diào)作用46-48
• 4、LXA4通過LXRα途徑促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)膽固醇流出并降低膽固醇含量48-52
• 討論52-58
• 全文小結(jié)58-59
• 參考文獻(xiàn)59-68
• 英文縮寫詞一覽表68-70
• 攻讀學(xué)位期間成果70-71
• 致謝71-73

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本文編號：1072951