本文關鍵詞：A族鏈球菌誘導細胞自噬機制的研究

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【摘要】：目的:自噬(autophagy)是指從粗面內質網(wǎng)的無核糖體附著區(qū)脫落的雙層膜,包裹部分胞質和細胞內需降解的細胞器、蛋白質等成分形成自噬體(autophagosome),并與溶酶體融合形成自噬溶酶體,降解其所包裹的內容物,以實現(xiàn)細胞本身的代謝需要和某些細胞器更新的基礎代謝過程。研究表明,多種因素諸如氧化應激、饑餓、高溫、細胞內損傷、細菌病毒感染等,都會誘發(fā)細胞自噬。細胞自噬對于機體正常穩(wěn)態(tài)有重要意義:饑餓應答進程中,在不同的器官如肝臟或培養(yǎng)細胞,由于氨基酸的匱乏,會誘導自噬,后者分解大分子,以產(chǎn)生分解代謝和合成代謝過程中所必須的中間代謝物;在細胞正�；顒舆^程中,如在動物的變態(tài)發(fā)育、老化和分化過程中,自噬負責蛋白降解以重建細胞。A族鏈球菌(GAS)是一類革蘭氏陽性球菌,人類約90%的鏈球菌感染是由GAS引起的。感染GAS后可引起化膿性疾病,如局部皮膚及皮下組織感染等,中毒性疾病如猩紅熱等,變態(tài)反應性疾病如風濕熱、急性腎小球腎炎等。GAS較強的侵襲力主要取決于其能產(chǎn)生多種胞外酶及毒素,例如脂磷壁酸(lipoteichoic acid,LTA)、M蛋白(M protein)、致熱外毒素(pyrogenic exotoxin)、溶血素(hemolysins)等。這些胞外酶和毒素都有其各自功能,例如脂磷壁酸可以增強細菌對宿主細胞的粘附性;M蛋白是GAS的主要毒力因子;致熱外毒素能改變血腦屏障的通透性;溶血素分為鏈球菌溶血素O和鏈球菌溶血素S,在鏈球菌引起超敏反應的過程中起著重要作用。在機體受到GAS入侵時,是否會發(fā)生細胞自噬;如果發(fā)生,那么GAS誘導細胞自噬的機制是什么?這些問題目前尚不清楚。本研究通過western blot,免疫熒光技術等檢測GAS、GAS缺陷菌株及GAS缺陷菌株刺激人喉癌上皮細胞Hep2后,檢測自噬相關蛋白LC3和P62的變化趨勢,以及用免疫熒光的方法檢測LC3蛋白的細胞原位表達變化來探究GAS全菌及其缺陷菌株是否誘導細胞發(fā)生自噬。而后,用純化的M蛋白,Fba A蛋白刺激Hep2細胞以驗證其在誘導自噬中的作用。接下來進一步用本室保存的分段蛋白刺激細胞,以尋找GAS誘導自噬發(fā)生的具體蛋白區(qū)段。方法:1用GAS刺激人喉癌上皮細胞Hep2,并用人肺癌細胞A549作為對照組,在侵襲細胞后,根據(jù)滲透壓原理得到胞內菌,不同倍數(shù)稀釋后涂于血平板培養(yǎng)基上,計算GAS的侵襲效率。2 Hep2細胞分別接受GAS,GAS缺陷菌株,GAS缺陷菌株刺激,用western blot檢測自噬相關蛋白LC3,P62在不同時間點的表達變化。3 Hep2細胞分別接受GAS,GAS缺陷菌株,GAS缺陷菌株刺激,應用免疫熒光技術檢測LC3的分布定位。4應用親和層析法純化Fba A蛋白,M蛋白。5 Hep2細胞分別接受兩種蛋白的刺激后,用western blot檢測自噬相關蛋白LC3,P62在不同濃度和不同時間點的表達變化。6用本實驗室保存的分段Fba A蛋白分別刺激Hep2細胞,用western blot檢測自噬相關蛋白LC3,P62在不同濃度和不同時間點的表達變化。結果:1 Hep2細胞受到GAS感染時的平均侵襲率為33%,而A549為25.6%。2 GAS和GAS缺陷菌株以MOI 1:100刺激Hep2細胞后,P62蛋白隨著刺激時間逐漸減少,LC3的兩種蛋白LC3-1逐漸降低,而LC3-2逐漸增加;當GAS缺陷菌株以MOI 1:100刺激細胞后,P62和LC3的兩種蛋白均沒有明顯的特征性變化。3免疫熒光檢測不同菌株刺激細胞后,LC3蛋白定位情況顯示:當GAS和GAS缺陷菌株刺激Hep2細胞6小時后,LC3蛋白呈現(xiàn)出聚集分布。當GAS缺陷菌株刺激細胞后,LC3蛋白的彌散分布狀態(tài)未改變。4 Fba A蛋白和M蛋白刺激細胞后,western blot結果顯示:當Fba A蛋白刺激細胞后,P62蛋白隨著刺激時間逐漸減少,同時LC3-1逐漸降低,而LC3-2逐漸增加;當M蛋白刺激細胞后,P62和LC3的兩種蛋白均沒有明顯的特征性變化。5 Fba A的四種分段蛋白37-104,104-277,68-164,164-320,分別刺激Hep2細胞,結果顯示:68-164區(qū)段蛋白刺激Hep2細胞后,呈現(xiàn)出自噬相關蛋白LC3-1隨著時間逐漸降低的趨勢,LC3-2隨著時間逐漸升高的趨勢;同時,自噬相關蛋白P62有隨著時間逐漸降低的趨勢。結論:1 GAS可以侵入Hep2及A549細胞,且侵襲率達到可研究水平。2 GAS及GAS缺陷菌株可誘導Hep2細胞發(fā)生自噬,而GAS缺陷菌株并未誘導細胞自噬的發(fā)生。3 GAS誘導Hep2細胞發(fā)生細胞自噬和GAS的毒性蛋白Fba A有關。4 Fba A誘導自噬的主要功能區(qū)定位于68-164蛋白區(qū)段內。
【關鍵詞】：細胞自噬 A族鏈球菌 LC3蛋白 P62蛋白 FbaA蛋白 M蛋白
【學位授予單位】：河北醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-11
• 英文縮寫11-12
• 前言12-13
• 材料與方法13-31
• 結果31-33
• 附圖33-38
• 附表38-39
• 討論39-41
• 結論41-42
• 參考文獻42-46
• 綜述46-56
• 參考文獻51-56
• 致謝56-57
• 個人簡歷57

【參考文獻】

中國碩士學位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 魏澎;GAS表面蛋白Fba保護性區(qū)段的鑒定及其表位的篩選[D];河北醫(yī)科大學;2009年

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本文編號：1067981