本文關(guān)鍵詞：CALR基因在MDS患者中的表達(dá)及其RNAi慢病毒載體對細(xì)胞生長和凋亡的影響

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【摘要】：目的:研究骨髓增生異常綜合征(MDS)患者中鈣網(wǎng)織蛋白基因(Calreticulin,CALR)的表達(dá),并構(gòu)建CALR-RNAi慢病毒載體,觀察其對人MDS細(xì)胞株SKM-1細(xì)胞生長和凋亡的影響。方法:收集重慶醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院血液科2010年~2014年的34例MDS患者骨髓標(biāo)本和8例非MDS患者骨髓標(biāo)本。按照WHO分型診斷標(biāo)準(zhǔn)和MDS國際預(yù)后積分系統(tǒng),將實驗組34例患者分為高危組和低危組,對照組取另外8例同期非MDS患者的骨髓標(biāo)本。所有骨髓標(biāo)本通過分離單個核細(xì)胞提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄制備為cDNA,使用RT-PCR技術(shù)檢測兩組骨髓標(biāo)本及SKM-1細(xì)胞中CALR的相對表達(dá)水平。首先查詢GenBank中CALR(human)的堿基序列,然后使用RNAi軟件設(shè)計3條RNAi靶序列、1條陰性對照序列。合成RNAi靶序列的單鏈DNA oligo,退火配對產(chǎn)生雙鏈,T4 DNA連接酶連接酶切后的慢病毒載體,轉(zhuǎn)化感受態(tài)大腸桿菌,PCR篩選陽性克隆并進(jìn)行測序鑒定,完成RNAi慢病毒載體的制備。共轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞進(jìn)行包裝得到3種GV-CALR-RNAi重組慢病毒載體。病毒滴度采用逐孔稀釋法進(jìn)行測定。三種GV-CALR-RNAi重組慢病毒分別穩(wěn)定轉(zhuǎn)染至SKM-1細(xì)胞中,通過流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率。后收集各組細(xì)胞,分別提取總rna及蛋白,通過rt-pcr檢測各組細(xì)胞calrmrna表達(dá)及westernblot技術(shù)檢測各組細(xì)胞calr蛋白質(zhì)的表達(dá)以驗證干擾效果,篩選出最佳靶向序列。使用含最佳靶向序列的慢病毒載體轉(zhuǎn)染skm-1細(xì)胞,cck-8法檢測干擾calr基因的表達(dá)對skm-1細(xì)胞生長的影響,流式細(xì)胞術(shù)觀察其對細(xì)胞周期的影響,annexinv/7-aad雙染法用流式細(xì)胞術(shù)觀察對細(xì)胞凋亡的影響,westernblot檢測凋亡蛋白caspase-3的水平。結(jié)果:應(yīng)用rt-pcr技術(shù)檢測34例低、高危mds標(biāo)本的calr表達(dá),絕大多數(shù)標(biāo)本calr基因表達(dá)明顯降低,顯著低于正常對照組(p0.01)。同時,檢測到人mds細(xì)胞株skm-1細(xì)胞中calr表達(dá)較正常對照明顯降低(p0.01)構(gòu)建的3組calr-rnai重組慢病毒轉(zhuǎn)染人mds細(xì)胞株skm-1后,倒置顯微鏡下觀察gfp熒光逐漸增強,至培養(yǎng)第5天表達(dá)最強,calr-rnai(2)、calr-rnai(3)慢病毒干擾組流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率均在70%以上,而calr-rnai(1)慢病毒干擾組流式細(xì)胞術(shù)檢測轉(zhuǎn)染效率在50%以下。rt-pcr檢測轉(zhuǎn)染后第5天實驗組calr-mrna表達(dá)水平,結(jié)果顯示calr-rnai(3)慢病毒載體與陰性對照組及空白對照組相比能有效降低calrmrna表達(dá)水平[(0.40±0.11),p0.01]。westernblot檢測結(jié)果也證實,calr-rnai(3)能有效敲除calr蛋白的表達(dá),確定為最佳靶點在SKM-1細(xì)胞中轉(zhuǎn)染CALR-RNAi(3)慢病毒及陰性對照組慢病毒,通過CCK-8法檢測SKM-1細(xì)胞的生長,發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)通過干擾CALR表達(dá)可促進(jìn)SKM-1細(xì)胞生長,細(xì)胞生長第5天統(tǒng)計學(xué)差異顯著(P0.05)。流式細(xì)胞術(shù)檢測實驗組和對照組細(xì)胞周期情況,結(jié)果顯示CALR-RNAi(3)組G0/G1期細(xì)胞比例(45.25±4.45)%低于空白對照組(54.12±1.36)%和陰性對照組(54.67±1.26)%,且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.019,P=0.014);而CALR-RNAi(3)組S期細(xì)胞比例細(xì)胞比例為(46.15±2.99),明顯高于空白對照組和陰性對照組[(38.42±2.11)%和(36.23±3.25)%,P0.05。AnnexinV/7-AAD雙染法用流式細(xì)胞儀檢測凋亡細(xì)胞,發(fā)現(xiàn)CALR-RNAi(3)組較陰性對照組和空白對照組細(xì)胞凋亡減少(圖7),且有顯著性差異(P0.05)。用Western blot檢測各組細(xì)胞中cleaved-caspase-3的表達(dá)。結(jié)果顯示,與陰性對照組和空白對照組相比,cleaved-caspase-3的表達(dá)在CALR-RNAi(3)組中明顯降低。結(jié)論:CALR基因在MDS中起到抑癌基因的作用,構(gòu)建的GV-CALR-RNAi(3)重組慢病毒載體有利于進(jìn)一步研究CALR基因在MDS中的作用機制。
【關(guān)鍵詞】：鈣網(wǎng)蛋白基因(CALR) RNA干擾 細(xì)胞生長 細(xì)胞凋亡 骨髓增生異常綜合征(MDS)
【學(xué)位授予單位】：重慶醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R551.3
【目錄】：

• 英漢縮略語名詞對照4-6
• 中文摘要6-9
• 英文摘要9-11
• 前言11-13
• 第一部分 CALR基因在骨髓增生異常綜合征患者中的表達(dá)水平及其RNAi慢病毒載體的構(gòu)建13-28
• 1 材料與方法13-20
• 2 結(jié)果20-25
• 3 討論25-26
• 4 結(jié)論26
• 5 參考文獻(xiàn)26-28
• 第二部分 干擾CALR基因表達(dá)對骨髓增生異常綜合征細(xì)胞系SKM-1 細(xì)胞生長和凋亡的影響28-36
• 1 材料與方法28-31
• 2 結(jié)果31-33
• 3 討論33-34
• 4 結(jié)論34
• 5 參考文獻(xiàn)34-36
• 全文總結(jié)36-37
• 文獻(xiàn)綜述：CALR基因在骨髓增生異常綜合征中的作用37-45
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 致謝45-46
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果及發(fā)表的學(xué)術(shù)論文46

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 孟凡榮;陳琛;萬海粟;周清華;;慢病毒載體及其研究進(jìn)展[J];中國肺癌雜志;2014年12期

2 肖志堅;;骨髓增生異常綜合征研究進(jìn)展[J];臨床血液學(xué)雜志;2013年04期

3 Shikha Snigdha;Erica D Smith;G Aleph Prieto;Carl W Cotman;;Caspase-3 activation as a bifurcation point between plasticity and cell death[J];Neuroscience Bulletin;2012年01期

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本文編號：1055929