發(fā)布時(shí)間：2017-10-18 09:48

  本文關(guān)鍵詞：不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基底對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞生物力學(xué)行為的影響

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【摘要】：心血管疾病(Cardio Vascular Disease,CVD)是全球人口發(fā)病率和死亡率最高的疾病之一,而動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)則是主要的心血管類疾病之一。在動(dòng)脈粥樣硬化疾病發(fā)生發(fā)展過程中,由于血管平滑肌細(xì)胞(Vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖遷移、基質(zhì)膠原大量沉積、細(xì)胞外基質(zhì)蛋白交聯(lián)等,血管壁硬度逐漸增加。隨著剛度增加,血管壁內(nèi)皮層滲透性增加,白細(xì)胞轉(zhuǎn)移增加,這也是動(dòng)脈粥樣硬化病變過程的標(biāo)志之一。目前,對(duì)動(dòng)脈粥樣硬化發(fā)病機(jī)理的研究多從VSMCs、炎癥細(xì)胞等入手,而從力學(xué)角度研究基底剛度與內(nèi)皮細(xì)胞(Endothelial Cells,ECs)相互作用的并不多見,血管病變過程中血管壁剛度的變化對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的鋪展、粘附、遷移等生物力學(xué)行為的影響及其可能的分子學(xué)機(jī)制,目前尚無定論。為了弄清內(nèi)皮細(xì)胞在動(dòng)脈粥樣硬化病變發(fā)展過程中對(duì)血管壁硬度變化的生物力學(xué)響應(yīng),從而更好地維護(hù)心血管的健康,本研究利用聚丙烯酰胺水凝膠(Polyarcylamide gel,PA gel),設(shè)計(jì)制備不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基底,模擬血管正常生理狀態(tài)和病變不同階段血管壁硬度,分析不同硬度基底對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞骨架組裝、細(xì)胞鋪展和遷移等行為的影響。在此基礎(chǔ)上,通過對(duì)“細(xì)胞外基質(zhì)—整合素—黏著斑—細(xì)胞骨架”這條與細(xì)胞鋪展遷移密切相關(guān)的信號(hào)軸上關(guān)鍵蛋白表達(dá)及其在細(xì)胞內(nèi)的分布,探尋基底硬度調(diào)控細(xì)胞鋪展、遷移等行為的作用規(guī)律。本文的主要內(nèi)容和結(jié)果:①聚丙烯酰胺凝膠基底的制備、表面修飾及表征。丙烯酰胺單體、甲叉雙丙烯酰胺交聯(lián)劑按不同配比聚合,動(dòng)靜態(tài)疲勞試驗(yàn)機(jī)測(cè)得不同配比丙烯酰胺水凝膠的楊氏模量E分別為11.12k Pa、33.01k Pa、57.61k Pa、80.66k Pa,可以較好的地模擬正常血管及病變血管的硬度。各硬度PA膠表面用I型鼠尾膠原(Col-I)修飾,原子力顯微鏡(Atomic force microscope,AFM)掃描分析修飾后的凝膠表面形貌顯示,PA膠表面粗糙度為1.682E+01nm,表面有錐形凸起,但最高不超過200nm。②基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形貌、鋪展、極化行為的影響。不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基底與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(Human umbilical vein endothelial cells,HUVECs)共培養(yǎng),細(xì)胞免疫熒光分析細(xì)胞骨架纖維組裝和排列隨基質(zhì)硬度的變化。在較軟基底表面生長(zhǎng)的細(xì)胞,細(xì)胞骨架纖維短小、纖細(xì),無法形成明顯纖維束,隨著基底硬度增加,骨架纖維變長(zhǎng)變粗,形成相互交聯(lián)的網(wǎng)狀纖維束,基底硬度越高,骨架纖維交聯(lián)度也越高;在較高硬度基底上,細(xì)胞骨架纖維排列發(fā)生極化,排列方向與細(xì)胞長(zhǎng)軸方向基本平行。利用活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)觀察記錄細(xì)胞形貌、鋪展、極化隨基底硬度的動(dòng)態(tài)變化。在較軟基底表面,內(nèi)皮細(xì)胞呈圓形,鋪展面積小,隨著基底硬度增加,細(xì)胞在基底表面的鋪展面積增大,細(xì)胞長(zhǎng)短徑比率增大;在80.66k Pa的較硬基底上,細(xì)胞極化現(xiàn)象明顯,呈梭型,并出現(xiàn)伸長(zhǎng)的尾部。③基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞遷移行為的影響。不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基底與內(nèi)皮細(xì)胞共培養(yǎng),活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)觀察記錄細(xì)胞遷移行為。單個(gè)HUVEC細(xì)胞遷移速率和位移均隨基底硬度增加而增大;細(xì)胞在軟基底上運(yùn)動(dòng)比較隨機(jī),方向變化較快,而較硬基底表面,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)更規(guī)律。④基底硬度對(duì)細(xì)胞內(nèi)力響應(yīng)蛋白分布及含量的影響。人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞分別在不同硬度聚丙烯酰胺凝膠基底上培養(yǎng)48h,分別用免疫熒光和免疫印跡檢測(cè)黏著斑蛋白vinculin和非肌肉型II型肌球蛋白(Non-muscle myosin II,NM II)在細(xì)胞內(nèi)的分布和表達(dá)情況。Vinculin表達(dá)量隨基底硬度增加而單調(diào)增加;NM II呈點(diǎn)狀彌散分布于細(xì)胞質(zhì)中,且隨基底硬度增加,其表達(dá)量增加。
【關(guān)鍵詞】：基底硬度 內(nèi)皮細(xì)胞 細(xì)胞鋪展 細(xì)胞遷移 非肌肉型II型肌球蛋白
【學(xué)位授予單位】：重慶大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 中文摘要3-5
• 英文摘要5-7
• 主要縮略詞表7-11
• 1 緒論11-20
• 1.1 問題的提出與研究意義11-12
• 1.1.1 問題的提出11-12
• 1.1.2 研究意義12
• 1.2 國(guó)內(nèi)外研究現(xiàn)狀12-17
• 1.2.1 細(xì)胞外基質(zhì)微環(huán)境力學(xué)特性與細(xì)胞12-13
• 1.2.2 基底剛度與細(xì)胞骨架、細(xì)胞形貌及鋪展13
• 1.2.3 基底剛度與細(xì)胞粘附、遷移13-14
• 1.2.4 基底剛度影響細(xì)胞生物力學(xué)行為的內(nèi)在機(jī)制14-15
• 1.2.5 基底剛度、細(xì)胞張力與非肌肉型II型肌球蛋白15-17
• 1.3 本文的研究目的、研究?jī)?nèi)容和技術(shù)路線17-19
• 1.3.1 研究目的17-18
• 1.3.2 研究?jī)?nèi)容18-19
• 1.3.3 技術(shù)路線19
• 1.4 本研究的創(chuàng)新點(diǎn)19-20
• 2 聚丙烯酰胺水凝膠基底制備、表面處理及性能檢測(cè)20-29
• 2.1 引言20-21
• 2.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑21
• 2.3 聚丙烯酰胺水凝膠基底制備、表面處理及性能檢測(cè)21-24
• 2.3.1 聚丙烯酰胺水凝膠制備原理21-22
• 2.3.2 聚丙烯酰胺水凝膠基底制備22
• 2.3.3 聚丙烯酰胺水凝膠表面處理22-24
• 2.3.4 聚丙烯酰胺水凝膠性能檢測(cè)24
• 2.3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析24
• 2.4 結(jié)果分析與討論24-27
• 2.4.1 聚丙烯酰胺凝膠（Col-I修飾）表面形貌檢測(cè)24-26
• 2.4.2 聚丙烯酰胺水凝膠楊氏模量測(cè)定26-27
• 2.5 本章小結(jié)27-29
• 3 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形貌、細(xì)胞鋪展行為的影響29-38
• 3.1 引言29
• 3.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑29-31
• 3.3 不同硬度聚丙烯酰胺水凝膠基底對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞形貌、鋪展行為影響31-32
• 3.3.1 不同硬度PA膠基底制備及表面修飾31
• 3.3.2 不同硬度PA膠表面細(xì)胞培養(yǎng)31
• 3.3.3 活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)觀察不同硬度PA膠表面單細(xì)胞形貌、鋪展情況31
• 3.3.4 細(xì)胞骨架免疫熒光檢測(cè)31-32
• 3.3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析32
• 3.4 結(jié)果分析與討論32-36
• 3.4.1 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞形貌和鋪展面積的影響32-35
• 3.4.2 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞極化性能影響35-36
• 3.4.3 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞骨架纖維組裝、排列的影響36
• 3.5 本章小結(jié)36-38
• 4 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移行為的影響38-44
• 4.1 引言38
• 4.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑38-39
• 4.3 基底硬度對(duì)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞遷移行為的影響39-40
• 4.3.1 不同硬度PA膠基底制備及表面修飾39-40
• 4.3.2 不同硬度PA膠表面細(xì)胞培養(yǎng)40
• 4.3.3 活細(xì)胞工作站實(shí)時(shí)檢測(cè)不同硬度PA膠表面內(nèi)皮細(xì)胞鋪展、遷移40
• 4.3.4 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析40
• 4.4 結(jié)果分析與討論40-42
• 4.4.1 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在不同硬度基底上運(yùn)動(dòng)參數(shù)分析40-41
• 4.4.2 人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞在不同硬度基底上細(xì)胞運(yùn)動(dòng)方向分析41-42
• 4.5 本章小結(jié)42-44
• 5 基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)力學(xué)響應(yīng)蛋白分布及表達(dá)的影響44-52
• 5.1 引言44
• 5.2 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑44-46
• 5.3 基底硬度對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞相關(guān)力學(xué)響應(yīng)蛋白分布及表達(dá)的影響46-49
• 5.3.1 不同硬度PA膠基底制備及表面修飾46
• 5.3.2 不同硬度PA膠表面細(xì)胞培養(yǎng)46
• 5.3.3 細(xì)胞內(nèi)力學(xué)響應(yīng)蛋白免疫熒光染色46-47
• 5.3.4 免疫印跡47-48
• 5.3.5 實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析48-49
• 5.4 結(jié)果分析與討論49-51
• 5.4.1 基底硬度對(duì)黏著斑蛋白Vinculin表達(dá)的影響49-50
• 5.4.2 基底硬度對(duì)非肌肉型II型肌球蛋白在細(xì)胞內(nèi)分布及表達(dá)影響50-51
• 5.5 本章小結(jié)51-52
• 6 結(jié)論與展望52-54
• 6.1 主要結(jié)論52-53
• 6.2 存在的不足和后續(xù)工作建議53-54
• 致謝54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 附錄60
• A. 作者在攻讀學(xué)位期間發(fā)表的論文60
• B. 作者在攻讀碩士學(xué)位期間曾參與的科研項(xiàng)目60

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8 范禎禎;高壓氧對(duì)實(shí)驗(yàn)兔腦血流量及腦血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡影響的實(shí)驗(yàn)研究[D];蘭州大學(xué);2015年

9 陳云霞;慢性間歇低氧大鼠模型內(nèi)皮細(xì)胞與中性多核白細(xì)胞相互作用致內(nèi)皮細(xì)胞損傷中炎癥機(jī)制的研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

10 楊錫蘭;川芎嗪對(duì)脂多糖誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞損傷的保護(hù)作用[D];蚌埠醫(yī)學(xué)院;2015年

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本文編號(hào)：1054209