本文關(guān)鍵詞：黃芪甲苷抑制載脂蛋白E基因缺陷小鼠心臟重構(gòu)的機(jī)制研究

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【摘要】：背景心臟重構(gòu)是指心臟受到各種內(nèi)外刺激后,心臟形態(tài)、結(jié)構(gòu)和功能等出現(xiàn)一系列適應(yīng)性改變,其病理特點(diǎn)主要包括心肌肥厚及間質(zhì)纖維化等,其病理機(jī)制主要涉及神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)的激活。心臟重構(gòu)早期為代償性適應(yīng),晚期失代償可發(fā)展為慢性心衰(congestive heart failure, CHF),而CHF是全球人群病死率的一個(gè)主要原因。因此,在臨床中,抑制心臟重構(gòu)是治療CHF的重要策略,如p受體阻滯劑、腎素-血管緊張素-醛固酮系統(tǒng)拮抗劑等抑制神經(jīng)內(nèi)分泌系統(tǒng)藥物的使用,對(duì)預(yù)防心臟重構(gòu)、治療CHF均取得一定效果。但CHF的發(fā)病率和病死率仍居高不下,因此研究心臟重構(gòu)分子機(jī)制及干預(yù)藥物具有必要性。高膽固醇血癥被認(rèn)為是心血管疾病,尤其是冠心病的主要危險(xiǎn)因素之一,它可增加全因死亡率,其負(fù)面臨床意義已得到反復(fù)證實(shí)。既往研究提示高膽固醇血癥是引起左心室肥厚的獨(dú)立危險(xiǎn)因素,在心臟重構(gòu)的發(fā)病及進(jìn)展中起重要作用。載脂蛋白E基因缺陷(ApoE-/-)小鼠是被廣泛用作研究高膽固醇血癥、動(dòng)脈粥樣硬化性等疾病的動(dòng)物模型,ApoE-/-除有血管表型外,還有如心臟質(zhì)量增加、室壁厚度增加、心肌纖維化和心功能減低等心臟表型改變。關(guān)于ApoE-/-小鼠心臟重構(gòu)的機(jī)制以及相關(guān)干預(yù)措施的研究很少。同時(shí),高膽固醇血癥對(duì)心肌細(xì)胞的再生、老化、凋亡以及P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的影響也知之甚少。黃芪甲苷(Astragaloside Ⅳ, AST Ⅳ)是從中藥黃芪中分離出來(lái)的一種羊毛脂醇型四環(huán)三萜天然單體皂苷,具多重抗心血管疾病藥理活性,既往研究證實(shí)AST Ⅳ可以抑制病毒感染、缺血缺氧等引起的心臟重構(gòu),降低心肌細(xì)胞凋亡率,減輕心肌纖維化,抗氧化應(yīng)激等。然而,AST Ⅳ對(duì)高膽固醇血癥引起的心臟重構(gòu)的影響及可能機(jī)制的研究尚無(wú)。因此,本研究目的是觀察AST Ⅳ干預(yù)ApoE-/-小鼠心臟重構(gòu)的療效及探索其相關(guān)機(jī)制。目的驗(yàn)證假說(shuō)：高膽固醇血癥可引起心肌細(xì)胞增殖能力改變,促進(jìn)心肌細(xì)胞老化、凋亡和心肌纖維化,影響P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活狀態(tài),最終導(dǎo)致以心肌肥厚、心功能下降為特點(diǎn)的病理性心臟重構(gòu);而AST Ⅳ治療能抑制高膽固醇血癥所致的心臟重構(gòu),進(jìn)而改善心功能。方法1. AST-Ⅳ準(zhǔn)備AST Ⅳ的純度≥98%,羥丙基-β-環(huán)糊精溶解為濃度1%和10% AST Ⅳ溶液。2.動(dòng)物分組雄性ApoE-/-小鼠隨機(jī)分為高脂模型組(KO,n=14),低濃度AST Ⅳ干預(yù)組(AST-LD,n= 7),高濃度AST Ⅳ干預(yù)組(AST-HD, n= 8),以同齡同性別野生型C57BL/6J小鼠(WT,n=15)為對(duì)照組。8周齡時(shí),分別獲取WT(n=8)和KO(n=7)組小鼠治療前各參數(shù)的基線水平。此后,AST-LD和AST-HD組分別隔日腹腔注射1mg/kg和10mg/kg的AST Ⅳ,余組以同方式同時(shí)長(zhǎng)給予等劑量溶劑,SPF級(jí)普食喂養(yǎng)。藥物干預(yù)8周(即小鼠16周齡),心臟超聲檢查后處死小鼠,取血及心臟標(biāo)本,保存待檢。3.心臟超聲、血脂和心臟質(zhì)量檢測(cè)小鼠麻醉后,超聲檢測(cè)左室內(nèi)徑及后壁厚度,計(jì)算左室射血分?jǐn)?shù)和縮短分?jǐn)?shù)。禁食不禁飲12小時(shí),稱重后取血處死,分離血漿以測(cè)血脂四項(xiàng)；取心臟標(biāo)本,測(cè)量心臟質(zhì)量和左心室質(zhì)量,隨后垂直于心臟縱軸將左心室分為兩部分,一部分用置于包埋劑用作冰凍切片,另一分部保存于超低溫冰箱后期備用。4.心肌纖維化,免疫熒光染色法,心肌細(xì)胞尺寸和數(shù)量的檢測(cè)馬松染色檢測(cè)心肌纖維化。免疫熒光染色檢測(cè)各目標(biāo)蛋白在心臟組織中的表達(dá)。使用心肌肌鈣蛋白Ⅰ單抗標(biāo)記心肌細(xì)胞；檢測(cè)目標(biāo)蛋白如與心臟的氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4(NOX4),抗氧化應(yīng)激相關(guān)蛋白超氧化物歧化酶1、2(SOD1、2),細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白Ki67,細(xì)胞老化相關(guān)蛋白P16 INK4a。參考文獻(xiàn)方法測(cè)量心肌細(xì)胞尺寸和數(shù)量。5.末端脫氧核苷酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)的dUTP缺口末端標(biāo)記測(cè)定法(TUNEL)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞死亡原位檢測(cè)試劑盒(熒光標(biāo)記法)用于檢測(cè)心肌細(xì)胞的凋亡。6.實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(QRT-PCR)檢測(cè)心臟基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)情況從心臟組織提取總RNA,逆轉(zhuǎn)錄成cDNA, QRT-PCR法檢測(cè)與細(xì)胞生長(zhǎng)周期、增殖、老化、P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、氧化應(yīng)激等相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。結(jié)果1.血脂四項(xiàng):ApoE-/-小鼠在8周齡時(shí)已進(jìn)展為高膽固醇血癥(TC和LDL-C較WT組分別上升3.7倍和8.7倍,甘油三酯(TG)不增高,HDL-C濃度較WT組下降23%)。16周齡時(shí),ApoE-/-小鼠血脂變化趨勢(shì)類(lèi)似。AST Ⅳ治療ApoE-/-小鼠8周后,血漿TC和LDL-C濃度較KO組上升,提示本實(shí)驗(yàn)中未觀察到ASTⅣ有降血漿膽固醇作用。2.心臟質(zhì)量和尺寸：ApoE-/-小鼠8周齡時(shí)心臟較WT組已表現(xiàn)為心肌肥厚,其心臟質(zhì)量(HW,1.1倍)、左心室質(zhì)量(LVW,1.3倍)、心臟質(zhì)量體重比(HW/BW,1.1倍)、左心室質(zhì)量體重比(LVW/BW,1.3倍)以及左心室質(zhì)量心臟質(zhì)量比(LVW/HW,1.2倍)均顯著增加,左心室長(zhǎng)軸(LAX)也增加1.1倍。16周時(shí)這些參數(shù)的差異仍然維持,AST IV治療8周后,這些參數(shù)在AST-HD組較KO組分別下降了HW 24%、LVW 28%/HW/BW 8%、LVW/BW 10%、LVW/HW 5%、 LAX 10%; AST-LD組沒(méi)有顯著改變。3.心臟超聲檢測(cè)結(jié)果：與上述心臟質(zhì)量和尺寸的變化趨勢(shì)一致。8周齡時(shí)ApoE-/-小鼠較WT組左室舒張末期內(nèi)徑(LVDd)增加14%,左室收縮末期內(nèi)徑(LVDs)增加11%,左室舒張末期容積(LVEDV)和左室收縮末期容積(LVESV)分別增加39%和30%。16周時(shí),除LVDs外,ApoE-/-小鼠LVESV較WT組增加至35%,左室射血分?jǐn)?shù)(LVEF)、縮短分?jǐn)?shù)(FS)、舒張期末左室后壁厚度(LVPWd).收縮期末左室后壁厚度(LVPWs)分別下降11%、13%、13%、6%。提示高膽固醇血癥小鼠心臟室壁厚度變薄和收縮功能受損變化。經(jīng)AST IV治療后,AST-HD組小鼠LAX減小,LVESV恢復(fù),EF由54%上升至60%,FS由28%上升至31%。AST-LD組較KO組在心臟超聲方面并沒(méi)有顯著差異。4.心臟纖維化：8周齡ApoE-/-小鼠較WT組左心室膠原蛋白含量沒(méi)有差異,但16周時(shí)膠原蛋白分?jǐn)?shù)是WT組2倍,高劑量AST Ⅳ治療后,膠原蛋白分?jǐn)?shù)減低至KO組一半。提示高膽固醇血癥易致心臟纖維化,AST Ⅳ具有明顯抑制心臟纖維化作用。5.心肌細(xì)胞體積和數(shù)量：8周齡ApoE-/-小鼠較WT組心肌細(xì)胞體積增加19%,心肌細(xì)胞數(shù)量無(wú)改變；16周,心肌細(xì)胞體積增加了38%,心肌細(xì)胞數(shù)量減少了14%。而AST-LD和AST-HD組小鼠的心肌細(xì)胞體積較KO組的分別減低了19%和27%,AST-HD組小鼠的心肌細(xì)胞數(shù)量較KO組相比增加了10%。6.增殖、老化蛋白的表達(dá)：8周齡ApoE-/-小鼠較WT組ki67陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)比例基本相等,16周時(shí)該比例減至WT組的80%,而高劑量AST Ⅳ治療后該比例較KO組增加3倍,ki67陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)心臟細(xì)胞總數(shù)比例增加2倍。其次,8周齡ApoE-/-小鼠較WT組在p16INK4a陽(yáng)性心肌細(xì)胞數(shù)占心肌細(xì)胞總數(shù)比例無(wú)差異,16周時(shí),該比例增為WT組的2.9倍,而低劑量和高劑量AST Ⅳ治療后該比例較KO組分別減低了39%和60%。ki67陽(yáng)性細(xì)胞占整個(gè)心臟細(xì)胞總數(shù)比例顯著減低55%。7.心臟細(xì)胞凋亡：8周齡ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞凋亡(2%)與WT組無(wú)差異。16周齡ApoE-/-小鼠凋亡心肌細(xì)胞數(shù)占總心肌細(xì)胞數(shù)比例超過(guò)WT組的23倍。AST-LD和AST-HD組的心肌細(xì)胞凋亡較KO組分別減少了87%和90%。凋亡陽(yáng)性細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)比例呈類(lèi)似變化規(guī)律。8.氧化應(yīng)激和抗氧化應(yīng)激：8周時(shí)ApoE-/-小鼠較WT組心臟NOX4陽(yáng)性細(xì)胞占心臟細(xì)胞總數(shù)比例、SOD1和SOD2的陽(yáng)性表達(dá)面積均無(wú)顯著改變；16周時(shí),ApoE-/-小鼠NOX4陽(yáng)性細(xì)胞占心臟總細(xì)胞比例是WT組的1.3倍,同時(shí)SOD2的陽(yáng)性表達(dá)面積顯著減小,SOD1相對(duì)表達(dá)面積沒(méi)有顯著差異。AST-LD和AST-HD組的NOX4陽(yáng)性細(xì)胞占心臟總細(xì)胞比例較KO組分別降低16%和17%,SOD1和SOD2的表達(dá)則均無(wú)顯著改變。9.目的基因轉(zhuǎn)錄：本實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了細(xì)胞周期、增殖、老化和P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路和氧化應(yīng)激相關(guān)基因表達(dá)的情況。1)8周時(shí),ApoE-/-小鼠較WT組Cyclin D1(2.2倍)和MCM5(2.7倍)上調(diào),CDKN1A (70%)和CDKN1B (28%)下調(diào),其余細(xì)胞周期相關(guān)基因在轉(zhuǎn)錄水平均無(wú)顯著改變。16周時(shí),ApoE-/-小鼠較WT組反映細(xì)胞生長(zhǎng)停滯的基因CDKN1A(7倍)、CDKN1B(2.7倍)、CDKN2A(9.6倍)明顯上調(diào),其中CDKN2A上調(diào)與前述翻譯產(chǎn)物p16INK4a蛋白質(zhì)表達(dá)變化一致,而CDK4(2.2倍),Cyclin B1(11.3倍).,Ki67(4.7倍)和MCM5(3.6倍)顯著上調(diào),其中Ki67mRNA表達(dá)與前述蛋白表達(dá)不完全一致。AST Ⅳ治療后CDKN1A, CDKN1B, CDKN2A, MCM5, Cyclin B1、D1、E1、A2和CDK4在AST-LD和AST-HD兩組均顯著下調(diào)。2)8周時(shí),ApoE-/-小鼠心臟除P53上調(diào)(1.6倍)和Mcl1下調(diào)(27%)之外,其余檢測(cè)的P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因(TP53、Bax、Bcl2、caspase-3、 Mdm2、ATM、GADD45A)較WT組沒(méi)有顯著差異；16周時(shí)除Bax和GADD45A外,其余檢測(cè)基因表達(dá)上調(diào)了2.5倍以上。AST IV治療后上述基因表達(dá)顯著下調(diào)。3)8周時(shí),ApoE/-小鼠心臟與氧化應(yīng)激相關(guān)基因(Duox1、Srxn1、NOX1、 NOX4、GPX2、SOD1)表達(dá)較WT組無(wú)顯著改變；16周時(shí),除Duox1和SOD1外,余檢測(cè)基因均出現(xiàn)了不同程度的上調(diào),AST Ⅳ治療后較KO組顯著下調(diào)。結(jié)論本研究中觀察到ApoE-/-小鼠心肌細(xì)胞增殖能力減低,細(xì)胞老化、凋亡加重,心肌纖維化和心臟中P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因表達(dá)增高,這些與高膽固醇血癥小鼠發(fā)生心肌肥厚、心臟收縮功能下降等病理性心臟重構(gòu)相關(guān)；AST Ⅳ治療并沒(méi)有降低ApoE-/-小鼠血脂濃度,但逆轉(zhuǎn)其心臟重構(gòu)、改善心功能,與其促進(jìn)心臟組織的增殖相關(guān)蛋白Ki67表達(dá)增加,減少老化相關(guān)蛋白p16INK4a表達(dá),抑制心肌細(xì)胞凋亡和心肌纖維化,調(diào)控心臟P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路相關(guān)基因的表達(dá)有關(guān)。本研究為AST Ⅳ應(yīng)用于臨床上治療血脂異常相關(guān)的心臟重構(gòu)提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：高膽固醇血癥 黃芪甲苷 心臟重構(gòu) 心肌細(xì)胞增殖和老化 細(xì)胞凋亡 P53信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R541
【目錄】：

• 中文摘要6-12
• 英文摘要12-21
• 1. 引言21-25
• 2. 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及材料25-31
• 3. 實(shí)驗(yàn)方法31-42
• 3.1 實(shí)驗(yàn)分組和藥物干預(yù)31
• 3.2 心臟超聲檢查31-32
• 3.3 標(biāo)本收集32
• 3.4 血脂檢測(cè)32-33
• 3.5 組織學(xué)和免疫熒光染色33-36
• 3.6 心臟凋亡檢測(cè)36-37
• 3.7 實(shí)時(shí)熒光定量PCR37-41
• 3.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析41-42
• 4. 結(jié)果42-56
• 4.1 小鼠血脂結(jié)果42-43
• 4.2 心臟重量及超聲檢測(cè)結(jié)果43-47
• 4.3 心肌纖維化及心肌細(xì)胞數(shù)量、體積測(cè)量結(jié)果47-49
• 4.4 心肌細(xì)胞增殖、老化及凋亡結(jié)果49-51
• 4.5 心臟NOX4及SOD表達(dá)結(jié)果51-53
• 4.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果53-56
• 5. 討論56-59
• 6. 結(jié)論59
• 參考文獻(xiàn)59-65
• 文獻(xiàn)綜述65-78
• 參考文獻(xiàn)74-78
• 附錄一：基金資助78
• 附錄二：攻讀碩士研究生期間發(fā)表文章78-79
• 附錄三：縮略詞79-82
• 致謝82

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 秦彥文;葉平;王綠婭;楊婭;;ApoE基因缺陷小鼠的心肌肥厚及辛伐他汀的干預(yù)研究[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進(jìn)展;2009年03期

2 李麗;陶輝宇;陳杰斌;鄧暉;呂建華;李雙杰;;黃芪甲甙保護(hù)阿霉素心肌損傷大鼠抗凋亡作用的機(jī)制研究[J];中國(guó)中西醫(yī)結(jié)合雜志;2006年11期

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本文編號(hào)：1050121