本文關鍵詞：VEGF調控縫隙連接蛋白Cx43促進EPCs增殖，遷移及損傷血管修復的研究

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【摘要】：1.背景和目的血管損傷性疾病是指各種原因引起血管結構或功能受損的疾病,發(fā)病率逐年升高,嚴重威脅人類健康。因此,如何促進損傷血管修復具有重大的科學研究價值和社會效益。內皮細胞排列在血管壁內層,在維持血管解剖和生理功能中發(fā)揮著重要的作用。各種病因可使內皮細胞受損,內皮完整性被破壞,最終導致動脈粥樣硬化,是血管損傷性疾病的中心環(huán)節(jié)和始動因素。過去大家普遍認為血管損傷的修復主要依靠鄰近成熟內皮細胞增殖并遷移至損傷區(qū)域。但成熟內皮細胞增殖能力較低,極大限制其在血管損傷修復中的作用。內皮祖細胞(endothelial progenitor cells,EPCs)來源于骨髓或脾臟等組織,是一類可分化為內皮細胞的祖細胞。既往許多研究證實,當血管損傷時,機體動員EPCs至外周血,經(jīng)血液循環(huán)歸巢到血管損傷區(qū)域,增殖、分化為內皮細胞,參與血管損傷修復。血管內皮生長因子(vascular endothelial groth factor,VEGF)在生物體內廣泛存在,有研究表明可體外增強EPCs分化、增殖等功能。而增加損傷血管局部VEGF表達,可促進EPCs歸巢至靶區(qū)域,分化為內皮、抑制平滑肌增殖,是血管損傷修復中的關鍵因素之一,但其具體機制尚不完全清楚。縫隙連接蛋白(connexin,Cx)是構成細胞間縫隙連接(gap juncition,GJ)的基本單位。6個縫隙連接蛋白在細胞膜上構成中空的通道即連接子(connexon)。相鄰細胞間的連接子吻合形成縫隙連接通道(gap junction channels,GJs),介導相鄰細胞間能量、物質交換。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20種縫隙連接蛋白中,Cx43在血管廣泛分布,是維持血管正常功能的重要成分,與血管損傷性疾病疾病發(fā)生發(fā)展密切相關。進一步研究指出,Cx43可介導干祖細胞間形成縫隙連接。因此,本研究擬觀察VEGF是否通過增強Cx43的表達,使縫隙連接功能增強,從而促進內皮祖細胞的增殖、遷移;此外,構建SD大鼠頸動脈損傷模型,探究Cx43是否參與VEGF介導的血管損傷修復。2.方法2.1 EPCs培養(yǎng),鑒定從大鼠脾臟組織中分離、培養(yǎng)EPCs,分別于培養(yǎng)的第1天、第4天和第7天鏡下觀察細胞形態(tài)并拍照,使用FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL雙染對細胞進行鑒定。用流式細胞儀對細胞表面的EPCs標志性抗原(CD34,VEGFR-2)進行鑒定。2.2免疫熒光檢測Cx43在EPCs中的表達和定位培養(yǎng)7天的EPCs,孵育Cx43一抗和熒光標記二抗,激光共聚焦顯微鏡下觀察EPCs中Cx43的表達和定位。2.3 Western blot檢測不同濃度VEGF調控EPCs中Cx43的表達及Cx43干擾si RNA轉染效果培養(yǎng)7天的EPCs,分別給予0、10、50ng/m L VEGF刺激,進行western blot實驗,觀察Cx43表達的差異;分別用生理鹽水、空載si RNA、Cx43干擾si RNA處理細胞,進行western blot實驗,觀察Cx43干擾si RNA的轉染效果。2.4熒光漂白恢復(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)實驗檢測VEGF調控Cx43對相鄰EPCs間縫隙連接功能的影響細胞實驗分為3組:(1)對照組(2)VEGF組(3)VEGF+si Cx43組。培養(yǎng)7天的EPCs根據(jù)分組處理后利用FRAP實驗檢測各組相鄰EPCs間縫隙連接功能,根據(jù)熒光恢復率評價縫隙連接功能;2.5觀察VEGF調控Cx43對EPCs增殖、遷移的影響培養(yǎng)7天的EPCs同步化后,按照細胞實驗分組處理后,CCK8檢測EPCs增殖活性,Transwell檢測EPCs遷移能力。2.6 VEGF調控Cx43參與血管損傷修復的在體研究2.6.1大鼠先行脾臟切除術,8天后再行頸動脈損傷。在大鼠頸動脈球囊損傷24小時后,將Dio-perchlorate標記的EPCs 2×10~6混懸在200μl PBS中從尾靜脈注射。細胞移植前按照動物實驗分組對細胞進行處理。為了觀察EPCs的歸巢情況,3天后處死大鼠,取出目標血管做冰凍切片進行熒光定位觀察。2.6.2頸動脈損傷7天后各組隨機選擇三只大鼠,血管內注射evans blue,15min后處死大鼠,取出目標血管,觀察再內皮化情況;頸動脈損傷14天后各組隨機選擇三只大鼠,處死后取出目標血管,HE染色觀察內膜增生情況。3.結果3.1成功從大鼠脾臟分離出單個核細胞,經(jīng)定向誘導培養(yǎng)后顯微鏡下見內皮系特征樣生長,FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL雙染陽性,雙染陽性率為92.00±2.23%(n=5),CD34和VEGFR-2在培養(yǎng)細胞中表達陽性率分別為89.67±1.39%(n=3)和92.07±1.35%(n=3),提示培養(yǎng)細胞為EPCs。3.2用激光共聚焦顯微鏡觀察,可見細胞質和細胞膜上均有Cx43發(fā)出的綠色熒光。3.3 WB實驗證實:10ng/m L組Cx43相對表達量顯著高于0ng/m L組(1.42±0.47 vs1.00±0.31,p0.05)(n=5),且50ng/m L組Cx43相對表達量顯著高于0ng/m L(2.07±0.49vs 1.00±0.31,P0.05)(n=5),50ng/m L組Cx43相對表達量顯著高于10ng/m L組(2.07±0.49 vs 1.42±0.47,P0.05)(n=5);Cx43si RNA轉染效率為62.95±7.71%(si Cx43組vs NS組,0.38±0.13 vs 1.00±0.14,p0.05)(n=3)。3.4熒光漂白恢復實驗(FRAP)證實:熒光物質能夠通過GJs在相鄰EPCs間傳遞。各組相鄰細胞熒光恢復率均顯著高于孤立細胞(control組相鄰細胞vs control組孤立細胞,25.85±4.00%vs 11.66±1.62%,p0.01),(VEGF組相鄰細胞vs VEGF組孤立細胞,65.65±6.24%vs 14.23±1.77%,p0.01),(VEGF+si Cx43組相鄰細胞vs VEGF+si Cx43組孤立細胞,31.31±1.53%vs 14.83±7.48%,p0.01)(n=6)。VEGF能促進EPCs間Cx43介導的縫隙連接(VEGF組vs control組,65.65±6.24%vs25.85±4.00%,p0.01)(n=6),抑制Cx43表達后,縫隙連接功能減弱(VEGF組vs VEGF+si Cx43組65.65±6.24%vs 31.31±1.53%,p0.01)(n=6)。3.5 VEGF調控Cx43對EPCs增殖、遷移功能的影響3.5.1 VEGF調控Cx43對EPCs增殖功能的影響使用光密度值(OD值)反映細胞增殖活性。CCK8分析提示:VEGF組EPCs增殖能力增強(VEGF組vs control組,1.73±0.07 vs 0.88±0.08,p0.01)(n=6),而抑制Cx43表達,EPCs增殖能力減弱(VEGF組vs VEGF+six43組,1.73±0.07 vs1.37±0.11,p0.01)(n=6)。3.5.2 VEGF調控Cx43對EPCs遷移功能的影響Transwell分析提示:VEGF組EPCs遷移數(shù)量增加(VEGF組vs control組,128.22±3.59個vs 84.14±4.58個,p0.01)(n=12),而抑制Cx43表達,EPCs遷移數(shù)量減少(VEGF組vs VEGF+si Cx43組,128.22±3.59個vs 104.00±3.92個,p0.05)(n=12)。3.6 VEGF調控Cx43參與血管損傷修復的在體研究3.6.1利用熒光標記示蹤法檢測Cx43對頸動脈損傷大鼠中EPCs歸巢的影響,熒光顯微鏡下觀察并計數(shù),生理鹽水組(saline組)血管內膜處未見到綠色熒光標記的EPCs;另外3組在血管內膜處均可見綠色熒光標記的EPCs。VEGF-EPCs組EPCs歸巢數(shù)量增加(VEGF-EPCs組vs EPCs組,15.67±2.08個vs 5.00±2.00個,p0.01)(n=3)(×100),而抑制Cx43表達,EPCs歸巢數(shù)量減少(VEGF-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,15.67±2.08個vs 10.67+2.08個,p0.05)(n=3)(×100)。3.6.2在血管損傷7天后使用伊文氏藍(evans blue)染色的方式檢測損傷血管再內皮化的情況。已經(jīng)完成再內皮化的部位不著色,沒有完成再內皮化的部位會被evans blue染為藍色。根據(jù)實驗方法所述,計算再內皮化率來評價損傷血管再內皮化程度。移植EPCS可促進損傷血管再內皮化(EPCs組vs saline組,18.39±1.83%vs 5.51±1.18%,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs組損傷血管內再內皮化增強(VEGF-EPCs組vs EPCs組,52.66±3.78%vs 18.39±1.83%,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表達,再內皮化減弱(VEGF-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,52.66±3.78%vs 29.58±2.44%,p0.01)(n=3)。3.6.3在血管損傷14天后先進行HE染色,通過軟件分別測定內膜(I)和中膜(M)的面積,通過內膜和中膜面積的比值(I/M)來評價Cx43對損傷血管內膜增生的作用。結果顯示:移植EPCs可抑制內膜增生(EPCs組vs saline組,0.714±0.024 vs0.835±0.025,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs組內膜增生減弱(VEGF-EPCs組vs EPCs組,0.278±0.018 vs 0.714±0.024,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表達,內膜增生加重(VEG-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,0.278±0.018 vs 0.402±0.116,p0.01)(n=3)。4.結論4.1大鼠脾臟中分離的單個核細胞通過定向培養(yǎng)可獲得EPCs。4.2 Cx43可在EPCs中表達,分布于細胞質和細胞膜上。4.3 VEGF可以促進Cx43的表達,且呈濃度依賴性;si RNA可以有效抑制EPCs中Cx43的表達。4.4 VEGF通過增加Cx43的表達增強相鄰EPCs間縫隙連接功能,從而增強細胞間的能量和物質交換。4.5 VEGF可通過增加Cx43的表達促進EPCs增殖,遷移。4.6 VEGF可通過增加Cx43的表達促進EPCs的歸巢及損傷血管再內皮化,抑制內膜增生。
【關鍵詞】：內皮祖細胞 血管內皮生長因子 縫隙連接蛋白43 增殖 遷移 血管損傷 再內皮化 內膜增生
【學位授予單位】：第三軍醫(yī)大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R54
【目錄】：

• 英文縮寫一覽表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-15
• 第二章 VEGF調控Cx43對EPCs增殖，遷移的影響15-31
• 2.1 實驗材料15-17
• 2.2 實驗方法17-22
• 2.3 結果22-29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 小結30-31
• 第三章 VEGF調控Cx43對頸動脈血管損傷修復的影響31-40
• 3.1 實驗材料31-32
• 3.2 實驗方法32-34
• 3.3 結果34-39
• 3.4 討論39
• 3.5 小結39-40
• 全文結論40-41
• 參考文獻41-45
• 文獻綜述 縫隙連接蛋白CX43在心血管疾病中的研究進展45-55
• 參考文獻50-55
• 研究生期間發(fā)表論文55-56
• 致謝56

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本文編號：1039094