本文關(guān)鍵詞：VEGF調(diào)控縫隙連接蛋白Cx43促進(jìn)EPCs增殖，遷移及損傷血管修復(fù)的研究

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【摘要】：1.背景和目的血管損傷性疾病是指各種原因引起血管結(jié)構(gòu)或功能受損的疾病,發(fā)病率逐年升高,嚴(yán)重威脅人類健康。因此,如何促進(jìn)損傷血管修復(fù)具有重大的科學(xué)研究?jī)r(jià)值和社會(huì)效益。內(nèi)皮細(xì)胞排列在血管壁內(nèi)層,在維持血管解剖和生理功能中發(fā)揮著重要的作用。各種病因可使內(nèi)皮細(xì)胞受損,內(nèi)皮完整性被破壞,最終導(dǎo)致動(dòng)脈粥樣硬化,是血管損傷性疾病的中心環(huán)節(jié)和始動(dòng)因素。過(guò)去大家普遍認(rèn)為血管損傷的修復(fù)主要依靠鄰近成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖并遷移至損傷區(qū)域。但成熟內(nèi)皮細(xì)胞增殖能力較低,極大限制其在血管損傷修復(fù)中的作用。內(nèi)皮祖細(xì)胞(endothelial progenitor cells,EPCs)來(lái)源于骨髓或脾臟等組織,是一類可分化為內(nèi)皮細(xì)胞的祖細(xì)胞。既往許多研究證實(shí),當(dāng)血管損傷時(shí),機(jī)體動(dòng)員EPCs至外周血,經(jīng)血液循環(huán)歸巢到血管損傷區(qū)域,增殖、分化為內(nèi)皮細(xì)胞,參與血管損傷修復(fù)。血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vascular endothelial groth factor,VEGF)在生物體內(nèi)廣泛存在,有研究表明可體外增強(qiáng)EPCs分化、增殖等功能。而增加損傷血管局部VEGF表達(dá),可促進(jìn)EPCs歸巢至靶區(qū)域,分化為內(nèi)皮、抑制平滑肌增殖,是血管損傷修復(fù)中的關(guān)鍵因素之一,但其具體機(jī)制尚不完全清楚�？p隙連接蛋白(connexin,Cx)是構(gòu)成細(xì)胞間縫隙連接(gap juncition,GJ)的基本單位。6個(gè)縫隙連接蛋白在細(xì)胞膜上構(gòu)成中空的通道即連接子(connexon)。相鄰細(xì)胞間的連接子吻合形成縫隙連接通道(gap junction channels,GJs),介導(dǎo)相鄰細(xì)胞間能量、物質(zhì)交換。在目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的20種縫隙連接蛋白中,Cx43在血管廣泛分布,是維持血管正常功能的重要成分,與血管損傷性疾病疾病發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。進(jìn)一步研究指出,Cx43可介導(dǎo)干祖細(xì)胞間形成縫隙連接。因此,本研究擬觀察VEGF是否通過(guò)增強(qiáng)Cx43的表達(dá),使縫隙連接功能增強(qiáng),從而促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的增殖、遷移;此外,構(gòu)建SD大鼠頸動(dòng)脈損傷模型,探究Cx43是否參與VEGF介導(dǎo)的血管損傷修復(fù)。2.方法2.1 EPCs培養(yǎng),鑒定從大鼠脾臟組織中分離、培養(yǎng)EPCs,分別于培養(yǎng)的第1天、第4天和第7天鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照,使用FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL雙染對(duì)細(xì)胞進(jìn)行鑒定。用流式細(xì)胞儀對(duì)細(xì)胞表面的EPCs標(biāo)志性抗原(CD34,VEGFR-2)進(jìn)行鑒定。2.2免疫熒光檢測(cè)Cx43在EPCs中的表達(dá)和定位培養(yǎng)7天的EPCs,孵育Cx43一抗和熒光標(biāo)記二抗,激光共聚焦顯微鏡下觀察EPCs中Cx43的表達(dá)和定位。2.3 Western blot檢測(cè)不同濃度VEGF調(diào)控EPCs中Cx43的表達(dá)及Cx43干擾si RNA轉(zhuǎn)染效果培養(yǎng)7天的EPCs,分別給予0、10、50ng/m L VEGF刺激,進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),觀察Cx43表達(dá)的差異;分別用生理鹽水、空載si RNA、Cx43干擾si RNA處理細(xì)胞,進(jìn)行western blot實(shí)驗(yàn),觀察Cx43干擾si RNA的轉(zhuǎn)染效果。2.4熒光漂白恢復(fù)(fluorescence redistribution after photobleaching,FRAP)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)VEGF調(diào)控Cx43對(duì)相鄰EPCs間縫隙連接功能的影響細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分為3組:(1)對(duì)照組(2)VEGF組(3)VEGF+si Cx43組。培養(yǎng)7天的EPCs根據(jù)分組處理后利用FRAP實(shí)驗(yàn)檢測(cè)各組相鄰EPCs間縫隙連接功能,根據(jù)熒光恢復(fù)率評(píng)價(jià)縫隙連接功能;2.5觀察VEGF調(diào)控Cx43對(duì)EPCs增殖、遷移的影響培養(yǎng)7天的EPCs同步化后,按照細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組處理后,CCK8檢測(cè)EPCs增殖活性,Transwell檢測(cè)EPCs遷移能力。2.6 VEGF調(diào)控Cx43參與血管損傷修復(fù)的在體研究2.6.1大鼠先行脾臟切除術(shù),8天后再行頸動(dòng)脈損傷。在大鼠頸動(dòng)脈球囊損傷24小時(shí)后,將Dio-perchlorate標(biāo)記的EPCs 2×10~6混懸在200μl PBS中從尾靜脈注射。細(xì)胞移植前按照動(dòng)物實(shí)驗(yàn)分組對(duì)細(xì)胞進(jìn)行處理。為了觀察EPCs的歸巢情況,3天后處死大鼠,取出目標(biāo)血管做冰凍切片進(jìn)行熒光定位觀察。2.6.2頸動(dòng)脈損傷7天后各組隨機(jī)選擇三只大鼠,血管內(nèi)注射evans blue,15min后處死大鼠,取出目標(biāo)血管,觀察再內(nèi)皮化情況;頸動(dòng)脈損傷14天后各組隨機(jī)選擇三只大鼠,處死后取出目標(biāo)血管,HE染色觀察內(nèi)膜增生情況。3.結(jié)果3.1成功從大鼠脾臟分離出單個(gè)核細(xì)胞,經(jīng)定向誘導(dǎo)培養(yǎng)后顯微鏡下見(jiàn)內(nèi)皮系特征樣生長(zhǎng),FITC-UEA-I和Di I-ac-LDL雙染陽(yáng)性,雙染陽(yáng)性率為92.00±2.23%(n=5),CD34和VEGFR-2在培養(yǎng)細(xì)胞中表達(dá)陽(yáng)性率分別為89.67±1.39%(n=3)和92.07±1.35%(n=3),提示培養(yǎng)細(xì)胞為EPCs。3.2用激光共聚焦顯微鏡觀察,可見(jiàn)細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上均有Cx43發(fā)出的綠色熒光。3.3 WB實(shí)驗(yàn)證實(shí):10ng/m L組Cx43相對(duì)表達(dá)量顯著高于0ng/m L組(1.42±0.47 vs1.00±0.31,p0.05)(n=5),且50ng/m L組Cx43相對(duì)表達(dá)量顯著高于0ng/m L(2.07±0.49vs 1.00±0.31,P0.05)(n=5),50ng/m L組Cx43相對(duì)表達(dá)量顯著高于10ng/m L組(2.07±0.49 vs 1.42±0.47,P0.05)(n=5);Cx43si RNA轉(zhuǎn)染效率為62.95±7.71%(si Cx43組vs NS組,0.38±0.13 vs 1.00±0.14,p0.05)(n=3)。3.4熒光漂白恢復(fù)實(shí)驗(yàn)(FRAP)證實(shí):熒光物質(zhì)能夠通過(guò)GJs在相鄰EPCs間傳遞。各組相鄰細(xì)胞熒光恢復(fù)率均顯著高于孤立細(xì)胞(control組相鄰細(xì)胞vs control組孤立細(xì)胞,25.85±4.00%vs 11.66±1.62%,p0.01),(VEGF組相鄰細(xì)胞vs VEGF組孤立細(xì)胞,65.65±6.24%vs 14.23±1.77%,p0.01),(VEGF+si Cx43組相鄰細(xì)胞vs VEGF+si Cx43組孤立細(xì)胞,31.31±1.53%vs 14.83±7.48%,p0.01)(n=6)。VEGF能促進(jìn)EPCs間Cx43介導(dǎo)的縫隙連接(VEGF組vs control組,65.65±6.24%vs25.85±4.00%,p0.01)(n=6),抑制Cx43表達(dá)后,縫隙連接功能減弱(VEGF組vs VEGF+si Cx43組65.65±6.24%vs 31.31±1.53%,p0.01)(n=6)。3.5 VEGF調(diào)控Cx43對(duì)EPCs增殖、遷移功能的影響3.5.1 VEGF調(diào)控Cx43對(duì)EPCs增殖功能的影響使用光密度值(OD值)反映細(xì)胞增殖活性。CCK8分析提示:VEGF組EPCs增殖能力增強(qiáng)(VEGF組vs control組,1.73±0.07 vs 0.88±0.08,p0.01)(n=6),而抑制Cx43表達(dá),EPCs增殖能力減弱(VEGF組vs VEGF+six43組,1.73±0.07 vs1.37±0.11,p0.01)(n=6)。3.5.2 VEGF調(diào)控Cx43對(duì)EPCs遷移功能的影響Transwell分析提示:VEGF組EPCs遷移數(shù)量增加(VEGF組vs control組,128.22±3.59個(gè)vs 84.14±4.58個(gè),p0.01)(n=12),而抑制Cx43表達(dá),EPCs遷移數(shù)量減少(VEGF組vs VEGF+si Cx43組,128.22±3.59個(gè)vs 104.00±3.92個(gè),p0.05)(n=12)。3.6 VEGF調(diào)控Cx43參與血管損傷修復(fù)的在體研究3.6.1利用熒光標(biāo)記示蹤法檢測(cè)Cx43對(duì)頸動(dòng)脈損傷大鼠中EPCs歸巢的影響,熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù),生理鹽水組(saline組)血管內(nèi)膜處未見(jiàn)到綠色熒光標(biāo)記的EPCs;另外3組在血管內(nèi)膜處均可見(jiàn)綠色熒光標(biāo)記的EPCs。VEGF-EPCs組EPCs歸巢數(shù)量增加(VEGF-EPCs組vs EPCs組,15.67±2.08個(gè)vs 5.00±2.00個(gè),p0.01)(n=3)(×100),而抑制Cx43表達(dá),EPCs歸巢數(shù)量減少(VEGF-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,15.67±2.08個(gè)vs 10.67+2.08個(gè),p0.05)(n=3)(×100)。3.6.2在血管損傷7天后使用伊文氏藍(lán)(evans blue)染色的方式檢測(cè)損傷血管再內(nèi)皮化的情況。已經(jīng)完成再內(nèi)皮化的部位不著色,沒(méi)有完成再內(nèi)皮化的部位會(huì)被evans blue染為藍(lán)色。根據(jù)實(shí)驗(yàn)方法所述,計(jì)算再內(nèi)皮化率來(lái)評(píng)價(jià)損傷血管再內(nèi)皮化程度。移植EPCS可促進(jìn)損傷血管再內(nèi)皮化(EPCs組vs saline組,18.39±1.83%vs 5.51±1.18%,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs組損傷血管內(nèi)再內(nèi)皮化增強(qiáng)(VEGF-EPCs組vs EPCs組,52.66±3.78%vs 18.39±1.83%,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表達(dá),再內(nèi)皮化減弱(VEGF-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,52.66±3.78%vs 29.58±2.44%,p0.01)(n=3)。3.6.3在血管損傷14天后先進(jìn)行HE染色,通過(guò)軟件分別測(cè)定內(nèi)膜(I)和中膜(M)的面積,通過(guò)內(nèi)膜和中膜面積的比值(I/M)來(lái)評(píng)價(jià)Cx43對(duì)損傷血管內(nèi)膜增生的作用。結(jié)果顯示:移植EPCs可抑制內(nèi)膜增生(EPCs組vs saline組,0.714±0.024 vs0.835±0.025,p0.01)(n=3);VEGF-EPCs組內(nèi)膜增生減弱(VEGF-EPCs組vs EPCs組,0.278±0.018 vs 0.714±0.024,p0.01)(n=3),而抑制Cx43的表達(dá),內(nèi)膜增生加重(VEG-EPCs組vs VEGF-si Cx43-EPCs組,0.278±0.018 vs 0.402±0.116,p0.01)(n=3)。4.結(jié)論4.1大鼠脾臟中分離的單個(gè)核細(xì)胞通過(guò)定向培養(yǎng)可獲得EPCs。4.2 Cx43可在EPCs中表達(dá),分布于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞膜上。4.3 VEGF可以促進(jìn)Cx43的表達(dá),且呈濃度依賴性;si RNA可以有效抑制EPCs中Cx43的表達(dá)。4.4 VEGF通過(guò)增加Cx43的表達(dá)增強(qiáng)相鄰EPCs間縫隙連接功能,從而增強(qiáng)細(xì)胞間的能量和物質(zhì)交換。4.5 VEGF可通過(guò)增加Cx43的表達(dá)促進(jìn)EPCs增殖,遷移。4.6 VEGF可通過(guò)增加Cx43的表達(dá)促進(jìn)EPCs的歸巢及損傷血管再內(nèi)皮化,抑制內(nèi)膜增生。
【關(guān)鍵詞】：內(nèi)皮祖細(xì)胞 血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子 縫隙連接蛋白43 增殖 遷移 血管損傷 再內(nèi)皮化 內(nèi)膜增生
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R54
【目錄】：

• 英文縮寫(xiě)一覽表4-5
• 英文摘要5-10
• 中文摘要10-14
• 第一章 前言14-15
• 第二章 VEGF調(diào)控Cx43對(duì)EPCs增殖，遷移的影響15-31
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料15-17
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法17-22
• 2.3 結(jié)果22-29
• 2.4 討論29-30
• 2.5 小結(jié)30-31
• 第三章 VEGF調(diào)控Cx43對(duì)頸動(dòng)脈血管損傷修復(fù)的影響31-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料31-32
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法32-34
• 3.3 結(jié)果34-39
• 3.4 討論39
• 3.5 小結(jié)39-40
• 全文結(jié)論40-41
• 參考文獻(xiàn)41-45
• 文獻(xiàn)綜述 縫隙連接蛋白CX43在心血管疾病中的研究進(jìn)展45-55
• 參考文獻(xiàn)50-55
• 研究生期間發(fā)表論文55-56
• 致謝56

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中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前10條

1 孫麗娜;Visfatin對(duì)內(nèi)皮祖細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制探討[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

2 薛國(guó)能;用于捕獲和歸巢EPCs的Fucoidan與CD133抗體/SDF-1復(fù)合生物涂層的構(gòu)建[D];西南交通大學(xué);2015年

3 張碩;骨髓源性EPCs對(duì)脊髓源性NSCs增殖分化的影響[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2015年

4 王芳娟;Klotho蛋白改善人EPCs功能、修復(fù)血管損傷的研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 高玉元;絲蛋白涂層彈簧圈可控釋放SDF-1α及其誘導(dǎo)EPCs參與大鼠動(dòng)脈瘤修復(fù)的實(shí)驗(yàn)研究[D];南方醫(yī)科大學(xué);2015年

6 買超平;中低海拔因素下冠心病患者EPCs數(shù)量及其與相關(guān)因子關(guān)系的實(shí)驗(yàn)性研究[D];蘭州大學(xué);2015年

7 王健;針?biāo)幉⒂脤?duì)氣虛血瘀證MCAO模型大鼠海馬VEGF表達(dá)及外周血EPCs數(shù)目的影響[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

8 黃佳雯;ZFP580調(diào)控eNOS/NO信號(hào)通路促進(jìn)EPCs分化的分子機(jī)制研究[D];天津醫(yī)科大學(xué);2015年

9 南偉;不同來(lái)源的EPCs對(duì)NSCs增殖分化的影響[D];蘭州大學(xué);2016年

10 鄭淑欣;負(fù)載骨髓MSCs和/或EPCs的羊膜支架修復(fù)犬長(zhǎng)段尿道缺損的研究[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2016年

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本文編號(hào)：1039094