發(fā)布時間：2017-10-12 02:26

  本文關鍵詞：在體評價A20的缺失對GlcN誘導的血管保護的影響

  更多相關文章： A20 O-GlcNAc修飾 球囊拉傷 內(nèi)膜增生

【摘要】：[目的]本研究旨在通過整體動物實驗,對比分析A20的缺失對血管損傷后新生內(nèi)膜形成的影響,探討A20缺失對GlcN誘導的血管保護效應的影響。[方法](1)重組腺病毒的包裝、擴增、有效性檢測：①用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染的方法來包裝AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP,并進一步擴增、收集腺病毒；②培養(yǎng)大鼠主動脈平滑肌并傳代,用腺病毒接種大鼠主動脈平滑肌,熒光顯微鏡下觀察效果,并提取細胞蛋白,檢測A20蛋白含量,驗證A20消減腺病毒的有效性。(2)構(gòu)建大鼠左側(cè)頸總動脈球囊拉傷模型及實驗分組：健康雄性SD大鼠,體重為350-400克,72只,隨機分為3大組,每組24只;① AD-shA20組(球囊拉傷左側(cè)頸總動脈+轉(zhuǎn)染AD-shA20-eGFP);② AD-NULL組(球囊拉傷左側(cè)頸總動脈+轉(zhuǎn)染AD-NULL-eGFP);③生理鹽水組(球囊拉傷左側(cè)頸總動脈+生理鹽水)。每大組分為兩種不同的處理：Vehicle組,GlcN治療組。大鼠用氯胺酮(80mg/kg)及賽拉嗪(5 mg／kg)聯(lián)合腹腔注射麻醉,取頸部正中切口,鈍性分離皮下組織,暴露頸總動脈、頸內(nèi)和頸外動脈的分叉處,分離左側(cè)頸外動脈至遠心端1cm,用顯微血管夾夾閉左側(cè)頸總動脈的近心端及頸內(nèi)動脈,以暫時性地阻斷血流,并用手術(shù)縫線結(jié)扎頸外動脈的遠心端；在左側(cè)頸外動脈剪一小切口,將2F Fogarty球囊導管沿頸外動脈的切口插入并送至左頸總動脈,用50微升的生理鹽水充盈球囊,來回抽動3次來剝脫頸總動脈內(nèi)膜。退出球囊后,向頸總動脈損傷血管的節(jié)段內(nèi)緩慢灌注相應的灌注液AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP、生理鹽水0.5ml并浸泡血管,局部作用約30分鐘后吸出,并恢復血流。AD-shA20+GlcN治療組、AD-NULL+GlcN治療組以及生理鹽水+GlcN治療組術(shù)后即刻給予GlcN (0.3mg·g-1·day-1 ip),連續(xù)注射14d。(3)術(shù)后第5天取每組大鼠3只,取出左側(cè)頸總動脈損傷節(jié)段,做冰凍切片,熒光顯微鏡下觀察綠色熒光蛋白的含量,藉以評估AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP的轉(zhuǎn)染效率。(4)術(shù)后第14天取各組左側(cè)損傷的頸總動脈以及右側(cè)作為對照,做石蠟切片進行HE染色,進行內(nèi)膜增生的形態(tài)學分析；(5)用WB法檢測左側(cè)球囊損傷血管壁組織的A20, P-P65, O-GlcN的表達水平。[結(jié)果](1)在轉(zhuǎn)染AD-shA20的RASMCs, A20蛋白表達明顯減少,表明AD-shA20-eGFP具有消減A20的作用,包裝的腺病毒有效。(2)熒光顯微鏡下觀察冰凍切片,可以見到血管內(nèi)膜及中膜有大量綠色熒光分布,證明球囊拉傷血管AD-shA20-eGFP、AD-NULL-eGFP轉(zhuǎn)染成功。(3)大鼠頸總動脈球囊損傷術(shù)后14d,各組大鼠的左側(cè)頸動脈內(nèi)膜跟右側(cè)未拉傷的血管相比,內(nèi)膜均有不同程度的增生,證明球囊拉傷手術(shù)成功。AD-NULL組和生理鹽水組,增加機體的O-GlcNAc修飾水平后,新生內(nèi)膜的增生明顯受到抑制；AD-shA20組,增加體內(nèi)的O-GlcNAc修飾水平,對新生內(nèi)膜的增生的抑制作用明顯減弱；且AD-shA20組在不增加O-GlcNAc修飾水平的情況下,新生內(nèi)膜增生的情況比其他組更顯著。(4)各組的G1eN處理后,O-GlcNAc修飾水平均明顯提高,各組A20表達略微升高；AD-NULL組和生理鹽水組提高O-GlcNAc修飾的水平可以抑顯著制P-P65的表達；AD-shA20組,A20蛋白的表達明顯降低,且提高O-GlcNAc修飾水平不能再明顯抑制P-P65的表達；AD-shA20組在不升高O-GlcNAc修飾水平的情況下(Vehicle處理),與其他組相比,P-P65的表達顯著升高。[結(jié)論]1.大鼠頸動脈球囊損傷后局部轉(zhuǎn)染AD-shA20可以降低局部組織A20的表達。2.提高機體的O-GlcNAc修飾水平,對球囊拉傷后血管新生內(nèi)膜的增生有抑制作用。3.A20的缺失可以削弱GlcN對球囊拉傷后血管新生內(nèi)膜的保護作用。
【關鍵詞】：A20 O-GlcNAc修飾 球囊拉傷 內(nèi)膜增生
【學位授予單位】：揚州大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R541.4
【目錄】：

• 中文摘要2-4
• 英文摘要4-8
• 中英文對照縮略詞表8-9
• 前言9-12
• 材料與方法12-25
• 結(jié)果25-32
• 討論32-37
• 結(jié)論37-38
• 參考文獻38-43
• 綜述43-56
• 參考文獻51-56
• 致謝56-57
• 攻讀碩士學位期間發(fā)表論文目錄57-58

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本文編號：1016129