本文關鍵詞：TIPE2誘導巨噬細胞凋亡在動脈粥樣硬化中的作用

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【摘要】：研究目的 動脈粥樣硬化(Atherosclerosis, AS)是一種嚴重威脅到人類健康的慢性炎癥性疾病,以動脈血管壁內膜血脂沉積、血管平滑肌細胞和纖維結締組織增生、內膜的纖維性增厚以及粥樣斑塊的形成為主要特征,但其具體機制尚不明確。近年的研究表明,局部和全身性的免疫反應貫于動脈粥樣硬化發(fā)病的全過程,伴隨著由單核/巨噬細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、淋巴細胞、肥大細胞及樹突狀細胞等組成的復雜細胞網(wǎng)絡之間的交互作用。其中,作為固有免疫系統(tǒng)重要成員之一的單核/巨噬細胞在動脈粥樣硬化這一疾病的發(fā)生及發(fā)展過程中的作用非常關鍵。活化后的巨噬細胞可以通過分泌炎性細胞因子、基質金屬蛋白酶等,對AS的發(fā)展起促進作用。此外,研究表明,巨噬細胞的凋亡在AS的發(fā)生、發(fā)展以及不穩(wěn)定斑塊的形成與破裂中發(fā)揮極其重要的作用。同時,巨噬細胞具有連接固有免疫與適應性免疫的橋梁作用,通過大量研究表明,巨噬細胞的凋亡發(fā)生于動脈粥樣硬化的多個環(huán)節(jié),對其機制的研究可為揭示動脈粥樣硬化發(fā)生的分子機制以及利用免疫手段干預動脈粥樣硬化的預防及治療奠定良好基礎。 TIPE2/,腫瘤壞死因子α誘導的蛋白8-2(Tumor necrosis factor-a induced protein-8-like2)是2008年發(fā)現(xiàn)的新型抗炎免疫分子。研究發(fā)現(xiàn),TIPE2可選擇性表達于胸腺、脾臟、淋巴結等免疫器官,此外尚可表達于具有內分泌功能的組織細胞、泌尿生殖細胞、造血細胞以及炎癥組織中。研究發(fā)現(xiàn),TIPE2-/-小鼠,會表現(xiàn)出脾臟腫大、體重下降以及白細胞增多等癥狀,并最終由于多器官發(fā)生炎癥而導致死亡。同時,通過對慢性乙型肝炎患者的外周血檢測發(fā)現(xiàn),在患者的單個核細胞中,TIPE2表達下調,并與血清AST、ALT水平等呈負相關,說明TIPE2可能與乙肝的發(fā)生有密切關系。同時,通過對糖尿病腎病的研究發(fā)現(xiàn),TIPE2腎小球中表達明顯上調,說明TIPE2可能與糖尿病腎病的發(fā)生有密切關系。研究還發(fā)現(xiàn),在SLE(系統(tǒng)性紅斑狼瘡)患者的外周血單個核細胞中,TIPE2表達被下調,同時,與病情的活動性指標之間存在負相關性,這些說明,說明TIPE2可能與系統(tǒng)性紅斑狼瘡的發(fā)生有密切關系。此外,TIPE2可通過負性調節(jié)機體的固有免疫及適應性免疫,發(fā)揮維持免疫穩(wěn)態(tài)的作用。本課題組前期研究表明,TIPE2具有抗動脈粥樣硬化作用,TIPE2基因缺失的巨噬細胞可抵抗LPS誘導的細胞死亡,這些現(xiàn)象提示TIPE2可能通過調節(jié)巨噬細胞的死亡影響動脈粥樣硬化的發(fā)生以及發(fā)展過程。因為細胞凋亡和細胞自噬均可引起細胞死亡,為此,為明確TIPE2調控細胞死亡的確切分子機制,本課題開展了對TIPE2與巨噬細胞凋亡與自噬的研究。利用體外細胞試驗系統(tǒng)地研究了動脈粥樣硬化發(fā)生時TIPE2與巨噬細胞中凋亡相關分子的關系及TIPE2在巨噬細胞自噬中的作用,這為進一步研究動脈粥樣硬化的免疫學機制提供了實驗和理論依據(jù),并且為動脈粥樣硬化的預防及治療提供新的靶點。 材料方法 1.腹腔巨噬細胞的誘導活化 取8-10周齡雄性C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-),腹腔注射6%的無菌淀粉,96小時后無菌分離取原代腹腔巨噬細胞,以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基放于37℃,5%C02的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),換液時,用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌一次,使未貼壁的巨噬細胞以及少量的紅細胞被棄掉,保留貼壁的巨噬細胞,然后換含雙抗的無血清DMEM培養(yǎng)基,靜息24小時,然后加以含oxLDL的完全培養(yǎng)基刺激,分別檢測TIPE2對巨噬細胞凋亡的調控和巨噬細胞自噬的調控,檢測TIPE2對巨噬細胞凋亡的死亡受體通路、線粒體凋亡通路以及內質網(wǎng)應激(ERS)中相關基因轉錄的調控并對相關信號通路進行檢測。 2.TIPE2對巨噬細胞死亡的調控 2.1檢測TIPE2對巨噬細胞死亡的影響 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后用臺盼藍染色后,顯微鏡下觀察拍照并做死亡細胞數(shù)量的百分比統(tǒng)計。 2.2.檢測TIPE2對巨噬細胞自噬的影響 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,Western bolt以及real-time PCR分別檢測LC3蛋白以及Atg5基因的表達。 2.3.檢測TIPE2對巨噬細胞凋亡的影響 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μ/ml的oxLDL刺激后用TUNEL染色后,顯微鏡下觀察拍照并做凋亡細胞數(shù)量的百分比統(tǒng)計。 2.3.1細胞凋亡的檢測 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,Annexin V/PI流式抗體孵育,用流式細胞儀檢測巨噬細胞的凋亡。 2.3.2TIPE2對巨噬細胞中caspase3活化的調控 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,Western bolt檢測caspase3以及cleaved-caspase3蛋白的表達。 3.TIPE2對巨噬細胞中相關基因轉錄調控的檢測 3.1TIPE2缺失巨噬細胞中外源性細胞凋亡通路的檢測 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,提RNA后逆轉錄獲得cDNA,用實時定量PCR的方法檢測細胞凋亡相關分子Fas,cFLIP的基因表達。 3.2.TIPE2缺失巨噬細胞線粒體凋亡通路相關基因的檢測 以上述上方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,提RNA后逆轉錄獲得cDNA,用實時定量PCR的方法檢測Bax,Bcl-2的基因表達。 3.3.TIPE2缺失巨噬細胞中內質網(wǎng)應激相關基因的檢測 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,提RNA后逆轉錄獲得cDNA,用實時定量PCR的方法檢測CHOP,GRP78的基因表達。 3.4.TIPE2缺失巨噬細胞中其他凋亡相關基因的檢測 以上述方法獲得的腹腔巨噬細胞,經50μg/ml的oxLDL刺激后收集細胞,提RNA后逆轉錄獲得cDNA,用實時定量PCR的方法檢測IAP2,TNFRSF12a的基因表達。 4.TIPE2對巨噬細胞相關信號通路的調控 取8-10周齡雄性C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-),腹腔注射6%的無菌淀粉,96小時后無菌分離取原代腹腔巨噬細胞,以含10%FBS的高糖DMEM培養(yǎng)基放于37℃,5%C02的培養(yǎng)箱中過夜培養(yǎng),換液時,用無血清DMEM培養(yǎng)基洗滌一次,使未貼壁的巨噬細胞以及少量的紅細胞被棄掉,保留貼壁的巨噬細胞,換含雙抗的無血清DMEM培養(yǎng)基,靜息24小時,然后加以oxLDL活化后收集細胞,Western bolt檢測信號通路分子AKT, p-AKT蛋白的表達。 實驗結果 1.TIPE2影響腹腔巨噬細胞的死亡 1.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞死亡細胞百分比下降 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞加以oxLDL刺激0,24,48h,分別用臺盼藍染色,鏡下觀察細胞,發(fā)現(xiàn)與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2缺失的腹腔巨噬細胞死亡率明顯下降。 1.2TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞自噬水平升高 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞分別加50μg/mloxLDL刺激0,24,48h后收集細胞,Western blot檢測LC3蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中,LC3-Ⅱ蛋白表達明顯上調,同時,0,24h后收集細胞, real-timePCR檢測Atg5基因的表達,發(fā)現(xiàn)與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中,Atg5基因表達也同時明顯上調。 1.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞凋亡水平降低 1.3.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞凋亡細胞百分比下降 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞加以oxLDL刺激0,24,48h,分別用Tunel染色,鏡下觀察細胞,發(fā)現(xiàn)與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2缺失的腹腔巨噬細胞凋亡細胞百分比顯著下降。 1.3.2TIPE2基因缺失抵抗腹腔巨噬細胞的凋亡 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞加以oxLDL刺激0,24h,經AnnexinV/PI細胞凋亡試劑盒染色,經流式細胞術檢測細胞凋亡率,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后巨噬細胞的凋亡率明顯下降。 1.3.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞caspase3活化受抑制 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠TIPE2的腹腔巨噬細胞分別加50μg/mloxLDL刺激0,24,48h后收集細胞,Western blot檢測caspase3及活化的caspase3(cleaved-caspase3)蛋白的表達,發(fā)現(xiàn)與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中,活化的caspase3蛋白表達明顯下調,而caspase3蛋白的表達水平與對照組無顯著性差異。 2.TIPE2對巨噬細胞中相關基因表達的影響 2.1TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中外源性細胞凋亡通路受抑制 oxLDL分別刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPEl2-/-)的腹腔巨噬細胞,實時定量PCR檢測Fas,cFLIP的基因表達,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬細胞中,抗凋亡的cFLIP基因表達明顯上調,但促凋亡的Fas基因表達下調,提示TIPE2基因缺失后外源性凋亡通路被抑制。 2.2TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中線粒體凋亡通路受抑制 oxLDL分別刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞,實時定量PCR檢測Bax,Bcl-2的基因表達,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬細胞中,抗凋亡的Bcl-2基因表達上調,但促凋亡的Bax基因表達下調,提示TIPE2基因缺失后線粒體凋亡通路被抑制。 2.3TIPE2基因缺失的腹腔巨噬細胞中內質網(wǎng)應激水平下調 oxLDL分別刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPEX2-/-)的腹腔巨噬細胞,實時定量PCR檢測CHOP,GRP78基因的表達,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后的巨噬細胞中CHOP,GRP78基因表達明顯下調。 2.4TIPE2影響巨噬細胞中其他凋亡相關基因的表達 oxLDL分別刺激C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞,實時定量PCR檢測IAP2,TNFRSF12a基因的表達,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬細胞中,抗凋亡的IAP2基因表達上調,但促凋亡的TNFRSF12a基因表達下調。 3.TIPE2缺失的腹腔巨噬細胞AKT活化增強 C57BL/6野生型小鼠以及TIPE2基因敲除小鼠(TIPE2-/-)的腹腔巨噬細胞分別加50μg/mloxLDL刺激0,5,15,38min后收集細胞,Western blot檢測AKT的活化情況,結果顯示,與C57BL/6野生型小鼠來源的腹腔巨噬細胞相比,TIPE2基因缺失后的腹腔巨噬細胞中,磷酸化的AKT表達增強,而AKT的表達水平與對照組無差異,說明TIPE2基因缺失后AKT信號通路活化增強。 結論 1.本課題進一步驗證,TIPE2通過誘導巨噬細胞死亡發(fā)揮抗動脈粥樣硬化作用； 2TIPE2通過調控外源性細胞凋亡通路、線粒體凋亡通路以及內質網(wǎng)應激等,發(fā)揮促進巨噬細胞凋亡的作用； 3.TIPE2促進巨噬細胞死亡的分子機制,可能與負性調節(jié)AKT的磷酸化有關； 4.此外發(fā)現(xiàn),TIPE2基因缺失的巨噬細胞自噬水平升高,提示動脈粥樣硬化發(fā)生中TIPE2具有抑制巨噬細胞自噬的作用,對動脈粥樣硬化的效應有待進一步深入研究。 創(chuàng)新點及意義 1.首次研究了動脈粥樣硬化發(fā)生中TIPE2與巨噬細胞凋亡的關系,提出TIPE2促進巨噬細胞凋亡的創(chuàng)新性論斷； 2.課題通過C57BL/6野生型小鼠、TIPE2基因敲除小鼠以及細胞模型,深入研究了TIPE2正常表達的巨噬細胞與TIPE2基因缺失的巨噬細胞,在接受oxLDL刺激后,外源性細胞凋亡通路、線粒體凋亡通路、內質網(wǎng)應激反應以及AKT的活化差異,揭示TIPE2促進巨噬細胞凋亡的分子機制； 3.為進一步的研究提供了實驗依據(jù)和理論依據(jù),為尋找動脈粥樣硬化免疫治療的靶點提供了方向。
【關鍵詞】：TNFAIP8L2 巨噬細胞 動脈粥樣硬化 細胞凋亡 細胞自噬
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2014
【分類號】：R543.5
【目錄】：

• 中文摘要8-14
• ABSTRACT14-21
• 符號說明21-23
• 前言23-26
• 技術路線26-27
• 材料和方法27-40
• 1. 實驗材料27-29
• 1.1 實驗動物和細胞27
• 1.2 主要試劑和耗材27-28
• 1.3 主要實驗儀器28-29
• 2. 實驗方法29-40
• 2.1 誘導與分離小鼠的腹腔巨噬細胞29-30
• 2.2 巨噬細胞死亡的檢測30-31
• 2.3 巨噬細胞自噬的檢測31-36
• 2.4 巨噬細胞凋亡的檢測36-37
• 2.5 相關基因的檢測37-38
• 2.6 檢測AKT的活化38-39
• 2.7 統(tǒng)計學分析39-40
• 結果40-43
• 1. TIPE2基因缺失的巨噬細胞死亡率降低40
• 2. TIPE2基因缺失的巨噬細胞自噬水平升高40
• 3. TIPE2基因缺失的巨噬細胞凋亡水平降低40-41
• 4. TIPE2對巨噬細胞凋亡相關通路的影響41-42
• 5. TIPE2缺失的巨噬細胞AKT的活化增強42-43
• 討論43-48
• 一、巨噬細胞與動脈粥樣硬化43
• 二、TIPE家族及其生物學功能43-45
• 三、TIPE2與巨噬細胞凋亡45-48
• 結論48-49
• 附圖49-54
• 參考文獻54-59
• 致謝59-60
• 攻讀學位期間主要科研成果60-61
• 學位論文評閱及答辯情況表61

【共引文獻】

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本文編號：1004959