本文關鍵詞：α-地中海貧血及β-地中海貧血電化學基因傳感器基因分型試劑的研制

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【摘要】：研究背景及目的地中海貧血,又稱“海洋性貧血”和“珠蛋白合成障礙性貧血”,簡稱地貧。它是一種隱性基因遺傳病,可導致遺傳性溶血性貧血,也是全球分布最廣、累積人群最多的一種單基因病。地中海貧血患者無法制造充足的血紅蛋白,進而無法將充足的氧氣輸送至全身各個器官及組織。器官及組織由于長期處于供氧不足的狀態(tài)進而無法正常工作繼而嚴重影響患者的正常生長發(fā)育。地中海貧血主要發(fā)生在地中海沿岸國家、東南亞、非洲和我國南方地區(qū),保守估計全世界地中海貧血基因攜帶者近2億人,其中包括我國南方廣西、廣東、海南等省份。地中海貧血是我國南方省份發(fā)病率最高、影響范圍最大的隱性遺傳病之一,其中尤以廣西、廣東最甚,據估計兩省地貧人數占全國總人數的2/5以上。地中海貧血主要包括α-地中海貧血和p-地中海貧血,a-地中海貧血和p-地中海貧血其分子基礎是分別位于16號染色體短臂末端16p13.3位點上的a珠蛋白基因簇的先天性遺傳缺陷及位于11號染色體短臂末端11p15.5位點上的p珠蛋白基因簇的先天性遺傳缺陷。α-地中海貧血多數情況因為一條染色體上1個或同時2個α珠蛋白基因缺失引起、少數情況由非缺失型突變引起的(αTα或ααT)。α+-地貧(-α)或α0地貧(--)攜帶者存在著下一代出現血紅蛋白H病(--/-α或--/αTa)或重型的Hb Bart's水腫綜合癥胎兒的風險。Hb H基因型與該病臨床癥狀嚴重程度相關,可以是重度貧血,也可以是輕度貧血。最常見的是α0-地貧復合α+-地貧的缺失型Hb H病,然而非缺失型的Hb H病也占有相當的比例。而我國最常見的三種非缺失型α地中海貧血Constant Springα (acsα) αβQuongSzeα (αβQSα) αWestmeadα(αwsα),在α-地中海貧血發(fā)病率最高的廣西有45.8-53.3%的Hb H病患者攜帶上述非缺失型α地貧基因。這類病人比那些缺失了3個α珠蛋白基因所表現出來的臨床癥狀更嚴重,貧血更嚴重。β-地中海貧血是由于p珠蛋白基因的突變從而引起β珠蛋白鏈合成減少(β+)或β珠蛋白鏈缺失(p0),而紅細胞膜與過剩的α鏈結合繼而引起的溶血性貧血。世界范圍內對該病都有不同程度的關注,世界所有人群和種族均存在其基因缺陷,地中海貧血在我國長江以南數個省份亦有較高的發(fā)病率[1]。p-地中海貧血珠蛋白基因的突變主要由于個別堿基的置換、插入或者缺失,因而具有高度異質性,目前為止全球已發(fā)現180多種突變類型,其中20多種突變類型在中國被發(fā)現[2,3]。中國β-地中海貧血發(fā)病人群中超過90%為發(fā)病率較高的CD41-42(-CTTT)、IVS-Ⅱ-654(C＞T)、CD17(AAGTAG)和-28(AG)4種β-地中海貧血突變類型。由于缺乏有效治療手段又存在較高的發(fā)病率,地中海貧血現在不僅是一個公共衛(wèi)生問題,也成為了中國南方一個社會經濟問題。應用相應分析技術通過人群篩查及產前診斷阻止重癥患兒出生是國內外公認的首選預防措施。目前,臨床上檢測地中海貧血基因點突變類型最常用的方法是斑點雜交(Dot blot)、反向斑點雜交(RDB)、等位基因特異PCR(ARMS-PCR)、多重等位基因特異PCR(Multi-ARMS-PCR)、基因芯片技術和基因測序。然而斑點雜交(Dot blot)、反向斑點雜交(RDB)要花費大量時間、操作繁瑣、穩(wěn)定性差、自動化程度低等缺點；等位基因特異PCR(ARMS-PCR)、多重等位基因特異PCR(Multi-ARMS-PCR)、基因芯片技術和基因測序具有靈敏度高、高通量等優(yōu)勢,但是由于其配備的大型檢測設備過于昂貴,這點限制了其在臨床的推廣應用。且往往一次只能單做a-地中海貧血基因分型檢測或單做β-地中海貧血基因分型檢測。以上方法均不能滿足臨床對于地中海貧血高危人群快速準確的基因篩查運用及其在各個基層醫(yī)院大范圍的推廣應用。生物傳感器技術是由生物化學、電化學、醫(yī)學以及電子技術等多學科相互滲透發(fā)展起來的一種新型的檢測技術。近年來電化學方法在檢測DNA雜交方面的優(yōu)點使得DNA電化學傳感器的研究得到廣泛關注。電化學傳感器進行DNA單堿基識別主要是基于DNA雜交反應中不同信號探針產生的不同電化學信號,其檢測的高度特異性基于堿基互補配對的高度選擇性。由于雜交后雙鏈DNA堿基對的堆積,電極表面形成有效的電子傳遞鏈。然而當堿基對中存在單個堿基錯配時,電子傳遞鏈會由于堿基堆積作用被破壞而中斷,而作起放大作用的雜交指示劑信號被中斷,從電化學輸出信號的變化可識別單堿基的錯配。DNA電化學基因傳感器的識別選擇性通過DNA雜交的三明治結構獲得較大的提高,因而DNA電化學基因傳感器的特異性比較高。DNA電化學基因傳感器生物芯片是將核酸雜交技術和電化學傳感器技術組合成的能簡單快速、準確廉價地幫助診斷患者疾病的新方法。該技術將在支持物(電極)上有規(guī)律的排列固定了大量的ssDNA探針,構成二維的ssDNA探針陣列,與電化學技術接合使用,可同時對大量的DNA進行檢測分析,其操作簡單、檢測效率高且自動化程度高。而且,根據不同固定探針的排列、不同分析方法的使用,DNA電化學基因傳感器生物芯片還有其他應用價值,如基因表達譜測定、突變檢測、多態(tài)性分析、基因組文庫作圖及雜交測序等。本研究采用電化學基因傳感器技術研制α-地中海貧血和β-地中海貧血電化學基因分型檢測試劑,能夠一次性簡便、快速地檢測中國人群常見的3種非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點和12種常見的β-地中海貧血點突變基因位點。這15種點突變基因位點包括：非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點：αCS、αQs、αwsp-地中海貧血點突變基因位點：-28(A＞C)、Cap(A＞C)、Int(ATGAGG)、 CD14-15(+G)、CD17(AAGTAG)、CD26(GAGAAG)、CD27-28(+C)、 CD31(-C)、CD41-42(-CTTT)、CD43(GT)、CD71-72(+A)和IVS-Ⅱ-654(C＞T)。以此為α-地中海貧血和p-地中海貧血(簡稱α-/β-地貧)的臨床輔助診斷提供一種新的方法。方法：(一)地中海貧血電化學基因傳感器的構建與優(yōu)化1.捕獲探針與信號探針的設計與合成：從NCBI基因數據庫中查找到地中海貧血α珠蛋白基因和β珠蛋白基因序列,針對3種非缺失型α-地中海貧血點突變基因位點和12種常見的β-地中海貧血點突變基因位點分別設計合成DNA捕獲探針和信號探針。且信號探針和捕獲探針序列為與α珠蛋白基因和p珠蛋白基因序列互補的鄰近序列。2. 電化學雜交模板的設計與合成：根據信號探針以及捕獲探針序列設計與兩條探針完全互補配對的序列,作為驗證地中海貧血基因電化學傳感器芯片的模板。3.雜交時間測試：使用點制好捕獲探針的電化學基因傳感器生物芯片,加入信號探針及雜交模板的雜交液,使雜交液覆蓋固定有特異性捕獲探針的PCB板上,將雜交模板與捕獲探針、信號探針的雜交時間設置為15min、 20min、25min、30min、35min、40min、45min和60min。采用電化學檢測儀檢測不同雜交時間內檢出的電化學信號值,通過雜交時間梯度實驗選出最佳雜交時間。4.雜交溫度測試：選取根據設計的探針Tm值(45。左右)選擇40℃-47℃的8個溫度作為待測雜交溫度,按前面得出的最佳雜交時間進行電化學雜交,后采用電化學檢測儀檢測不同雜交溫度下檢出的電化學信號值,通過雜交溫度梯度實驗選出最佳雜交溫度。5.信號探針濃度優(yōu)化：通過Au-S鍵的形成,將濃度為6pmol/L S-S-ssDNA捕獲探針固定至金電極表面形成SAM。點制好捕獲探針的芯片通過清洗及組裝工藝組裝成電化學基因傳感器生物芯片。固定雜交模板濃度,信號探針濃度依次為1.5pmol/L、2.5pmol/L、3.5pmol/L.4.5pmol/L.5.5pmol/L、6.5pmol/L. 7.5pmol/L、8.5pmol/L、9.5pmol/L和10.5pmol/L,采用電化學檢測儀檢測不同信號探針濃度檢出的電化學信號值,通過信號探針濃度梯度實驗選出各個信號探針的最佳濃度。(二)地中海貧血電化學基因傳感器PCR檢測方法的建立1.引物的設計與合成：采用Primer Premier 5.0軟件和Oligo 6軟件設計可以擴增目的片段的特異性引物HBA-F與HBA.R、HBB.1F與 HBB-1R、HBB-2F與HBB-2R、HBB-3F與HBB-3R。其中HBA-F與HBA-R擴增1個α珠蛋白基因片段,HBB-1F與HBB-1R、HBB-2F與HBB-2R、HBB-3F與HBB-3R分別擴增3個β珠蛋白基因。2.多重不對稱PCR擴增體系優(yōu)化：以野生型人全血基因組為模板,依次從單重對稱PCR擴增、單重不對稱PCR擴增到多重不對稱PCR擴增進行引物用量測試,結合電泳及電化學檢測信號值兩個結果調整體系中引物用量,確定各對引物在整個多重不對稱PCR擴增體系中的最佳用量。(三) 地中海貧血電化學基因傳感器基因分型的性能驗證提取由三家三級甲等醫(yī)院收集的901例臨床全血樣本的基因組DNA,進行金標準測序的同時用前述業(yè)已建立的電化學基因傳感器檢測方法,對這些樣本中的15個地中海貧血基因位點進行定性檢測,最終檢測電化學檢測結果與測序結果的一致性進而驗證電化學基因傳感器檢測方法的檢測能力及可靠性。結果：(一) 地中海貧血電化學基因傳感器的構建與優(yōu)化捕獲探針與信號探針及電化學雜交模板設計成功后由進行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。45min內,雜交時間的增加電化學信號值呈增高趨勢,但30min至45min的4個雜交時間中,信號值升高的幅度大幅下降,基于檢測時間和檢測信號最佳平衡考慮,我們將雜交時間設為30min. 40℃,41℃和42℃條件下,出現的非特異信號均較高,不利于后期結果的判斷,而44℃-47℃條件下,雖然幾乎非特異信號,但是本身信號值降低也十分明顯,最終確定雜交溫度為43℃。捕獲探針濃度固定為6pmol/L,固定雜交模板濃度,檢測二茂鐵信號探針濃度的線性范圍。當信號探針的濃度低于3.5pmo1/L時,電化學信號值變化較小；當信號探針濃度大于3.5pmol/L時,電化學信號值開始明顯增加；信號探針濃度升到5.5pmol/L時,電化學信號值開始大幅度增高；而當信號探針濃度大于8.5pmol/L時,電極的電化學信號值基本無太大變化,說明地中海貧血電化學基因傳感器檢測的線性范圍在一定程度上受二茂鐵信號探針濃度的影響,最終確定各個信號探針濃度為7pmol/L～8.5pmol/L之間。(二) 地中海貧血電化學基因傳感器PCR檢測方法的建立引物設計成功后由進行上海生工生物(Sangon Biotech)公司合成。確定多重不對稱PCR反應體系為50μL,含10× buffer (TAKARA) 5μL、dNTPs(25 mmol/L) 0.4μL、Betaine(5mmol/L) 8μL、Hot start Taq酶(1OU/μL) 0.3μL、濃度為10pmol/L的上游引物HBA-F0.2μL, HBB-1F、HBB-2F、HBB-3F各0.1μL,濃度為10pmol/L的下游引物HBA-R、HBB-1R、HBB-2R, HBB-3R各1μL,DNA模板2μL。確定PCR反應條件為94℃預變性15分鐘,然后按94℃ 45秒→58℃30秒→72℃ 45秒擴增,35個循環(huán),最后72℃延伸10分鐘。(三) 地中海貧血電化學基因傳感器基因分型的性能驗證應用901例臨床樣本驗證地中海貧血電化學基因傳感器特性,除4例樣本由于本身質量問題提取失敗外,15種地中海貧血點突變基因位點均能被正確識別。與測序結果有極好的一致性。當靶DNA與相應的捕獲探針及不同二茂鐵標記的信號探針序列完全互補配對時,電極上相應氧化還原電位的電化學信號急劇上升；當探針與靶DNA互補序列中存在單個堿基錯配時,相同信號探針濃度和靶DNA濃度下,存在錯配的序列其電化學信號值較完全互補序列小很多,甚至不產生電化學信號。因此,本實驗設計的地中海貧血電化學基因傳感器能準確地區(qū)分相應的基因型別。結論：通過對反應條件的優(yōu)化,以Thiol-Modifier C6 S-S標記探針為捕獲探針,二茂鐵標記探針為信號探針,基于堿基互補配對原理,通過夾心法構建的地中海貧血電化學基因傳感器基因分型試劑,用于檢測地中海貧血點突變基因分型具備現實的可行性。在一定的樣本濃度范圍內,本實驗設計的地中海貧血電化學基因傳感器可準確辨別DNA序列中的單堿基突變,因而具有較好的特異性。本實驗制備的地中海貧血電化學基因傳感器通過后續(xù)的研究和改進還可以進一步提高檢測的靈敏度和準確性,且生物傳感器具有操作簡便,價格低廉,更易于在臨床上推廣應用的優(yōu)點,有望經進一步優(yōu)化后應用于生產。Development of an electrochemical DNA sensor for the detection of α-thalassemia and β-thalassemia
【關鍵詞】：電化學基因傳感器 DNA雜交 α-地中海貧血 β-地中海貧血 基因分型
【學位授予單位】：南方醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R556.61;R440
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-20
• 前言20-35
• 第一章 地中海貧血電化學基因傳感器的構建與優(yōu)化35-50
• 1.1 材料36-38
• 1.2 實驗方法38-43
• 1.3 結果43-47
• 1.4 討論47-49
• 1.5 小結49-50
• 第二章 地中海貧血電化學基因傳感器PCR檢測方法的建立50-66
• 2.1 材料52-54
• 2.2 實驗方法54-60
• 2.3 結果60-62
• 2.4 討論62-65
• 2.5 小結65-66
• 第三章 地中海貧血電化學基因傳感器基因分型的性能驗證66-78
• 3.1 材料67-69
• 3.2 實驗方法69-71
• 3.3 結果71-76
• 3.4 討論76-77
• 3.5 小結77-78
• 參考文獻78-82
• 中英文縮略詞82-83
• 碩士期間論文發(fā)表情況83-84
• 致謝84-85

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前2條

1 胡雙林;倪林仙;樊茂;奎莉越;;19例地中海貧血的基因診斷[J];現代檢驗醫(yī)學雜志;2005年06期

2 張懷;張云懷;李靜;肖鵬;喬雷;李澤全;樊小燕;;DNA共價修飾單壁碳納米管電極的制備及與VB_6相互作用的研究[J];分析測試學報;2008年08期

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本文編號：1004198