本文關(guān)鍵詞：XOD誘導(dǎo)人肝細胞系L-02細胞自噬模型的建立及線粒體機制研究

  更多相關(guān)文章： 自噬 黃嘌呤氧化酶(XOD) 活性氧(ROS) 線粒體 氧化應(yīng)激

【摘要】：【背景】自噬(autophagy)是一種自我消化過程,可將各種待消化物質(zhì)降解成為能夠被重新利用的營養(yǎng)成分,從而達到在清除受損細胞器或大分子的同時最大限度地利用自身營養(yǎng)成分的目的。自噬是一種普遍存在的生命現(xiàn)象,它在眾多生理及病理條件下均發(fā)揮重要作用。正常條件下,細胞的自噬維持在一個相對較低的水平,但多種應(yīng)激條件可誘導(dǎo)自噬水平的升高,包括氧化應(yīng)激。氧化應(yīng)激是指機體或細胞產(chǎn)生的過多活性氧(reactive oxygen species,ROS)無法被抗氧化防御體系所清除,造成的應(yīng)激作用。氧化應(yīng)激與自噬的相關(guān)性已有很多文獻報道,但具體機制仍不清楚。在以往氧化應(yīng)激與自噬的研究中,自噬通常伴有大量凋亡或壞死,為一種病理性損傷性自噬,而氧化應(yīng)激誘導(dǎo)生理性自噬研究甚少。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是一種將黃嘌呤、次黃嘌呤分解并產(chǎn)生ROS的氧化還原酶,已被作為氧化劑廣泛應(yīng)用于研究中。本研究在篩選氧化劑誘導(dǎo)自噬模型過程中,發(fā)現(xiàn)XOD可明顯誘導(dǎo)L-02細胞自噬,那么該模型與經(jīng)典自噬模型以及已有的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)的自噬模型有何優(yōu)勢?其中機制如何?對以上問題的系統(tǒng)研究將對建立優(yōu)效的氧化應(yīng)激誘導(dǎo)自噬模型,以及針對自噬的分子機制和生物學(xué)作用研究提供數(shù)據(jù)和支撐。【目的】1.建立一種xod誘導(dǎo)的細胞自噬模型;2.探討xod誘導(dǎo)自噬模型過程中線粒體氧化應(yīng)激作用及分子機制�！痉椒ā�1.體外培養(yǎng)l-02細胞,采用不同濃度氧化劑(h2o2、gox、t-bhp、pq和xod)、自噬誘導(dǎo)劑(ebss和rapamycin)、自噬抑制劑(3-ma)以及多種抗氧化劑(nac、和mitoq)對細胞進行處理;2.采用免疫熒光檢測自噬標(biāo)志蛋白lc3Ⅱ分布狀況,mdc染色檢測自噬溶酶體數(shù)量及分布;3.westernblot檢測標(biāo)志蛋白lc3Ⅱ、p62等蛋白水平以及akt、erk、ampk、p38、mtor和ulk1等細胞信號通路分子的激活狀況;4.透射電子顯微鏡觀察線粒體和細胞自噬小體的形態(tài)及數(shù)量;5.dcfh-da和mito-soxred染色流式法分別檢測細胞ros和線粒體ros水平;6.jc-1染色,共聚焦觀察細胞膜電位變化;7.mn-sod及cat試劑盒檢測細胞內(nèi)sod2及cat活性;8.熒光定量pcr檢測細胞內(nèi)線粒體dna拷貝數(shù);9.mrfp-gfp-lc3腺病毒轉(zhuǎn)染細胞,以觀察細胞自噬通量;10.采用sirna對細胞內(nèi)atg5基因進行干擾,降低atg5蛋白的表達;11.采用慢病毒轉(zhuǎn)染細胞以單獨高表達細胞內(nèi)sod2、cat以及m-cat,或共轉(zhuǎn)染同時高表達sod2cat以及sod2m-cat;12.annexinv-fitc/pi細胞凋亡檢測試劑盒檢測細胞凋亡水平�！窘Y(jié)果】1.l-02細胞活力隨各氧化劑(h2o2、gox、t-bhp、pq和xod)濃度增大而降低,一定濃度h2o2、t-bhp、pq和xod處理條件下,自噬標(biāo)志蛋白lc3Ⅱ水平均有不同程度升高。2.l-02細胞經(jīng)無細胞毒性劑量xod處理后,mdc染色結(jié)果顯示,指示酸性自噬泡的藍色熒光點明顯增多且亮度增強,免疫熒光法標(biāo)記lc3蛋白的熒光點增多,westernblot檢測的lc3Ⅱ蛋白水平明顯上調(diào),tem結(jié)果顯示細胞的自噬體形成增加,各指標(biāo)均呈一定的劑量效應(yīng)關(guān)系。mRFP-GFP-LC3腺病毒轉(zhuǎn)染L-02細胞后再給予XOD處理,細胞自噬通量明顯增加。3.XOD、EBSS以及Rapamycin分別處理L-02細胞,2h、8h和24h后分別檢測自噬相關(guān)指標(biāo)MDC染色、IF-LC3染色、LC3Ⅱ蛋白水平,以及細胞自噬小體數(shù)量的變化,結(jié)果顯示XOD較經(jīng)典自噬誘導(dǎo)劑各指標(biāo)變化均更為明顯。4.通過劑量篩選,一定劑量的t-BHP、PQ和XOD均可使L-02細胞LC3Ⅱ蛋白水平明顯升高,但在引起細胞自噬的同時,t-BHP和PQ可引起明顯的細胞凋亡或壞死,而XOD處理組細胞存活狀態(tài)無明顯變化。5.XOD處理細胞后,細胞內(nèi)總體ROS及線粒體ROS水平明顯升高。給予NAC或MitoQ處理后,Western Blot結(jié)果顯示自噬標(biāo)志蛋白LC3Ⅱ水平明顯下降。此外,通過慢病毒轉(zhuǎn)染過表達抗氧化酶SOD2和/或CAT/M-CAT,各組ROS水平均有不同程度的降低,其中SOD2CAT和SOD2M-CAT共轉(zhuǎn)染組細胞內(nèi)總ROS以及線粒體ROS水平均明顯降低,在此基礎(chǔ)上,XOD處理引起的LC3Ⅱ蛋白水平也相應(yīng)明顯降低。6.XOD處理L-02細胞后,Western Blot結(jié)果顯示ROS相關(guān)信號通路AKT、p38/MAPK、ERK和AMPK以及自噬相關(guān)蛋白ULK1蛋白磷酸化水平顯著增加。聯(lián)合過表達SOD2CAT和SOD2M-CAT抗氧化蛋白后可以有效拮抗XOD處理引起的AKT、AMPK及ULK1蛋白磷酸化水平的升高。7.抑制XOD誘導(dǎo)的自噬,細胞內(nèi)ROS和線粒體ROS水平及細胞的死亡程度均增加。8.XOD處理L-02細胞后,JC-1結(jié)果顯示線粒體膜電位降低,TEM觀察細胞內(nèi)有線粒體自噬現(xiàn)象,免疫熒光雙標(biāo)發(fā)現(xiàn)LC3自噬熒光點與線粒體共定位,即發(fā)生了線粒體自噬,且熒光定量PCR檢測到線粒體DNA拷貝數(shù)明顯減少。【結(jié)論】我們成功建立了XOD誘導(dǎo)L-02細胞的自噬模型,與常規(guī)自噬誘導(dǎo)劑相比該模型具有誘導(dǎo)效果明顯、易檢測及不伴隨凋亡或壞死等優(yōu)點。線粒體ROS在介導(dǎo)了此過程的發(fā)生,ROS通過信號通路AKT和AMPK誘導(dǎo)自噬的發(fā)生。線粒體自噬可以通過調(diào)控線粒體數(shù)量進而調(diào)控ROS水平,維持細胞生存。
【關(guān)鍵詞】：自噬 黃嘌呤氧化酶(XOD) 活性氧(ROS) 線粒體 氧化應(yīng)激
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-14
• 前言14-15
• 文獻回顧15-33
• 1 自噬的概念15
• 2 自噬的基本過程15-16
• 3 自噬的基本生物學(xué)作用和功能16-22
• 4 自噬的調(diào)控22-29
• 5 研究自噬的常用工具和方法29-33
• 1 材料33-35
• 1.1 實驗對象33
• 1.2 主要試劑33-35
• 1.3 主要儀器35
• 2 方法35-42
• 2.1 細胞培養(yǎng)35-36
• 2.2 細胞活力測定36
• 2.3 Western Blot36
• 2.4 MDC染色36-37
• 2.5 免疫熒光37
• 2.6 自噬體顯微觀察37-38
• 2.7 siRNA轉(zhuǎn)染38
• 2.8 ROS測定38-39
• 2.9 L-02細胞慢病毒轉(zhuǎn)染39-40
• 2.10 腺病毒轉(zhuǎn)染40
• 2.11 SOD2活性檢測40-41
• 2.12 CAT活性檢測41
• 2.13 細胞凋亡檢測41-42
• 2.14 熒光定量PCR42
• 2.15 統(tǒng)計學(xué)分析42
• 3 結(jié)果42-68
• 3.1 氧化應(yīng)激自噬模型的建立42-47
• 3.2 XOD誘導(dǎo)自噬模型的確立47-53
• 3.3 XOD誘導(dǎo)的自噬模型的優(yōu)勢評價53-57
• 3.4 ROS介導(dǎo)XOD誘導(dǎo)的自噬57-61
• 3.5 XOD誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制61-62
• 3.6 XOD誘導(dǎo)的自噬對細胞的保護作用62-64
• 3.7 線粒體在XOD誘導(dǎo)自噬過程中的作用64-68
• 4 討論68-76
• 4.1 氧化應(yīng)激模型的建立68-70
• 4.2 XOD誘導(dǎo)自噬模型的確立70-72
• 4.3 XOD誘導(dǎo)的自噬模型的優(yōu)勢評價72-73
• 4.4 線粒體ROS介導(dǎo)XOD誘導(dǎo)的自噬73
• 4.5 XOD誘導(dǎo)細胞自噬的分子機制73-74
• 4.6 XOD誘導(dǎo)的自噬對細胞的保護作用74-75
• 4.7 線粒體在XOD誘導(dǎo)自噬過程中的作用75-76
• 小結(jié)76-77
• 參考文獻77-85
• 個人簡歷和研究成果85-86
• 致謝86

【相似文獻】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 葉青;鄭民華;;自噬的分子機制與病理生理意義[J];國際病理科學(xué)與臨床雜志;2007年04期

2 何韜;王海杰;譚玉珍;;自噬在細胞存活和死亡中的作用[J];生理科學(xué)進展;2008年01期

3 張志才;邵增務(wù);;自噬分子機制的研究進展[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2008年01期

4 趙勇;師長宏;伍靜;張海;;自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控機制[J];中國比較醫(yī)學(xué)雜志;2010年10期

5 王梅;李慶林;;自噬與癌癥的治療[J];安徽醫(yī)藥;2010年08期

6 伍靜;趙勇;師長宏;張海;;自噬的形態(tài)特征及分子調(diào)控[J];現(xiàn)代生物醫(yī)學(xué)進展;2010年20期

7 王雄;譚璐;;自噬研究進展[J];亞太傳統(tǒng)醫(yī)藥;2010年10期

8 卞龍艷;;運動與自噬的關(guān)系進展研究[J];齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報;2011年07期

9 王偉;徐忠東;陶瑞松;;腫瘤發(fā)生過程中自噬與凋亡關(guān)系的研究[J];合肥師范學(xué)院學(xué)報;2011年06期

10 王光輝;;自噬與疾病[J];生物化學(xué)與生物物理進展;2012年03期

中國重要會議論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 韋雪;漆永梅;張迎梅;;鎘、活性氧自由基與自噬發(fā)生的分子機制[A];中國活性氧生物學(xué)效應(yīng)學(xué)術(shù)會議論文集（第一冊）[C];2011年

2 秦正紅;粱中琴;陶陸陽;黃強;劉春風(fēng);蔣星紅;倪宏;邢春根;;自噬在細胞生存與死亡中的作用[A];中國藥理學(xué)會第九次全國會員代表大會暨全國藥理學(xué)術(shù)會議論文集[C];2007年

3 秦正紅;;自噬與腫瘤和神經(jīng)細胞生存——藥物作用的新靶位[A];全國生化與分子藥理學(xué)藥物靶點研討會論文摘要集[C];2008年

4 李芹;丁壯;;自噬功能研究進展[A];中國畜牧獸醫(yī)學(xué)會家畜傳染病學(xué)分會第八屆全國會員代表大會暨第十五次學(xué)術(shù)研討會論文集[C];2013年

5 胡晨;張璇;滕衍斌;胡海汐;周叢照;;家蠶中自噬相關(guān)蛋白Atg8的結(jié)構(gòu)研究[A];華東六省一市生物化學(xué)與分子生物學(xué)會2009年學(xué)術(shù)交流會論文摘要匯編[C];2009年

6 陳希;李民;Xiao-Ming Yin;李林潔;;通過不同途徑誘導(dǎo)自噬的化合物對Atg9的依賴性不同[A];細胞—生命的基礎(chǔ)——中國細胞生物學(xué)學(xué)會2013年全國學(xué)術(shù)大會·武漢論文摘要集[C];2013年

7 陳涓涓;敬靜;蔡元博;張俊龍;;針對活體細胞自噬行為的發(fā)光金屬配合物的設(shè)計[A];中國化學(xué)會第28屆學(xué)術(shù)年會第8分會場摘要集[C];2012年

8 寧曉潔;鐘自彪;王彥峰;付貞;葉啟發(fā);;缺血再灌注誘導(dǎo)小鼠肝細胞自噬[A];2013中國器官移植大會論文匯編[C];2013年

9 吳曉琦;李丹丹;鄧蓉;江山;楊芬;馮公侃;朱孝峰;;CaMKKβ磷酸化Beclin 1調(diào)控自噬及其在腫瘤治療中的作用[A];2011醫(yī)學(xué)科學(xué)前沿論壇第十二屆全國腫瘤藥理與化療學(xué)術(shù)會議論文集[C];2011年

10 周鴻雁;裴中;陳杰;申存周;錢浩;劉妍梅;冼文彪;鄭一帆;陳玲;;線粒體動力改變參與了LRRK2突變導(dǎo)致的自噬[A];中華醫(yī)學(xué)會第十三次全國神經(jīng)病學(xué)學(xué)術(shù)會議論文匯編[C];2010年

中國重要報紙全文數(shù)據(jù)庫 前3條

1 生命學(xué)院;俞立課題組在《科學(xué)》發(fā)文揭示自噬調(diào)控的重要機制[N];新清華;2012年

2 周飛 張粹蘭;花櫚木“自噬”可抗癌[N];廣東科技報;2011年

3 張明永;水稻自噬基因研究取得新進展[N];廣東科技報;2011年

中國博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 賈盛楠;轉(zhuǎn)錄因子p8調(diào)控自噬的功能研究[D];浙江大學(xué);2015年

2 皮會豐;DNM1L蛋白介導(dǎo)的線粒體自噬在鎘致肝臟毒性中的作用研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

3 李倩;miRNAs介導(dǎo)的自噬抑制在類鼻疽桿菌感染免疫逃逸中的作用機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

4 黎炳護;激活TRPV1誘導(dǎo)自噬在血管平滑肌細胞泡沫化中作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

5 陳江偉;自噬在椎間盤退變中的作用及機制研究[D];上海交通大學(xué);2014年

6 李榮榮;自噬在布比卡因肌毒性中的作用及機制研究[D];南京醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王維;NF-κB信號通路參與介導(dǎo)的自噬在高血壓大鼠心血管重構(gòu)的作用研究[D];山東大學(xué);2015年

8 劉春朋;日糧硒缺乏對雞肝臟蛋白質(zhì)組學(xué)及自噬變化的影響[D];東北農(nóng)業(yè)大學(xué);2015年

9 梁蓓蓓;P53凋亡刺激蛋白ASPP2調(diào)控細胞自噬的研究[D];上海交通大學(xué);2012年

10 李少瑩;自噬在LPS誘導(dǎo)的肺泡上皮細胞死亡中的作用及機制研究[D];第三軍醫(yī)大學(xué);2015年

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 李寧;自噬在嗎啡心肌保護中的作用及機制研究[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

2 劉冰;腦缺血預(yù)處理對大鼠局灶性腦缺血再灌注后自噬及凋亡的影響[D];河北聯(lián)合大學(xué);2014年

3 王存凱;microRNA-30a-5p通過抑制自噬阻止肝星狀細胞激活[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

4 張宇程;泛素連接酶HOIL-1L在線粒體自噬中的功能與機制研究[D];中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

5 唐芙蓉;自噬對奶山羊雄性生殖干細胞生物學(xué)特性的影響[D];西北農(nóng)林科技大學(xué);2015年

6 陳軍童;腎損傷分子1對高糖誘導(dǎo)人腎小管上皮細胞自噬作用的影響[D];鄭州大學(xué);2015年

7 包勇;Kap1在LBH589誘導(dǎo)的乳腺癌細胞MCF-7自噬形成中的作用[D];復(fù)旦大學(xué);2013年

8 王彬彬;模擬高原缺氧大鼠腸上皮細胞損傷自噬調(diào)控機制的研究[D];甘肅中醫(yī)藥大學(xué);2016年

9 張君莉;NIX在CCCP誘導(dǎo)PC12細胞線粒體自噬調(diào)控作用的研究[D];成都醫(yī)學(xué)院;2016年

10 校鑫;九節(jié)龍皂苷Ⅰ對多種人腦膠質(zhì)瘤細胞系自噬活性增強作用的體外研究[D];第四軍醫(yī)大學(xué);2014年

，

本文編號：999500