本文關鍵詞：LRP1介導的α-MMC肝細胞毒性發(fā)生機制研究

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【摘要】：研究背景α-MMC是從苦瓜籽中提取并分離出的I型核糖體失活蛋白,能失活核糖體而誘導腫瘤細胞和病毒感染的細胞凋亡,具有顯著的抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性,但其體內應用時也出現(xiàn)了明顯的肝功能異常等細胞毒性,從而阻止了臨床應用。探討α-MMC肝細胞毒性機制,以改善毒性并保障安全用藥是發(fā)揮其抗腫瘤作用的前提。研究目的以L02正常肝細胞株為實驗對象,探明LRP1介導的α-MMC肝細胞毒性發(fā)生機制。材料與方法采用CCK-8試劑檢測α-MMC誘導正常肝細胞L02、正常乳腺細胞MCF-10A、正常腎細胞AD293、正常肺細胞BEAS-2B的增殖率以計算各細胞的半數(shù)抑制率IC50,并對α-MMC誘導L02細胞的細胞凋亡進行形態(tài)學觀察及流式細胞儀檢測凋亡率;之后對α-MMC進行FITC標記,于激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC-α-MMC進入L02、BEAS-2B及AD293的圖像;以放射性配體分析實驗驗證α-MMC的細胞膜受體并計算受體密度及結合親和力;最后以siRNA法沉默L02細胞上的LRP1蛋白表達,觀察α-MMC的細胞毒效果及在不同時間點對早期凋亡蛋白的誘導作用。實驗結果(1)α-MMC作用于L02、BEAS-2B、MCF-7、MCF-10A、AD293細胞的IC50分別為5.077±1.03μg/ml、15.03±2.26μg/ml、30.19±2.45μg/ml、77.43±2.54μg/ml和104.9±4.73μg/ml。α-MMC能明顯誘導細胞凋亡。(2)激光共聚焦顯微鏡術可觀察到α-MMC在4h后可進入L02、BEAS-2B、AD293細胞。在L02細胞內其熒光強度最強,BEAS-2B細胞次之,AD293細胞最弱。2倍摩爾量的α2-M能明顯減弱FITC-α-MMC在L02細胞中的亮度。(3)放射性配體結合分析可看到α-MMC與L02細胞的特異性結合,其親和力Kd值為47.1±7.54 nM/L,L02、BEAS-2B和AD293細胞的受體密度分別為14260.7±1422.8個/cell、7823±447.5個/cell和872±91個/cell。(4)對L02細胞的LRP1進行基因沉默(siRNA)后,其α-MMC的IC50升高為173.6±3.79μg/ml,α-MMC細胞進入量也明顯減少。α-MMC作用于L02細胞后,凋亡蛋白JNK、Bad蛋白、P53蛋白和活化Caspase9蛋白被激活而明顯升高,而經siRNA處理后,JNK、Bad、Active Caspase9和P53信號蛋白的活化被顯著抑制。結論α-MMC對體外培養(yǎng)的肝細胞L02有較強的細胞毒性,這種毒性作用是通過誘導細胞凋亡達到的;α-MMC可通過與細胞膜特異性受體LRP1結合而被介導入胞,該受體密度越高,α-MMC進入細胞的量就越多,對細胞的毒性也越大;α-MMC也可以通過LRP1介導的JNK信號通路誘導細胞凋亡。由此我們推導出α-MMC的肝細胞毒性機制,即通過LRP1受體介導的α-MMC內吞和JNK信號傳到通路兩條途徑誘導肝細胞凋亡,從而導致肝細胞死亡。
【關鍵詞】：α-MMC 肝細胞毒性 LRP1 細胞凋亡 信號轉導
【學位授予單位】：成都醫(yī)學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 第一部分 α-MMC對肝細胞的毒性作用及其機制13-27
• 1 引言13
• 2 實驗材料13-16
• 2.1 實驗藥品、細胞株及試劑13-14
• 2.2 主要儀器14-15
• 2.3 主要配置溶液15-16
• 3 實驗方法16-20
• 3.1 細胞凍存16-17
• 3.2 細胞復蘇17
• 3.3 細胞培養(yǎng)與傳代17-18
• 3.4 細胞計數(shù)18
• 3.5 蛋白濃度測定18
• 3.6 SDS-PAGE及銀染18-19
• 3.7 細胞毒實驗19
• 3.8 L02細胞凋亡實驗19-20
• 4 實驗結果20-25
• 4.1 α-MMC銀染染色結果圖20-21
• 4.2 蛋白濃度測定21-22
• 4.3 α-MMC的細胞毒實驗結果22-23
• 4.4 細胞凋亡形態(tài)學觀察23-24
• 4.5 流式細胞儀測定細胞凋亡率24-25
• 5 討論25-27
• 第二部分 α-MMC受體介導的內吞途徑研究及其受體確認27-49
• 1 引言27
• 2 實驗材料27-30
• 2.1 試劑27-29
• 2.2 主要儀器29
• 2.3 主要配置溶液29-30
• 3 實驗方法30-37
• 3.1 α-MMC細胞膜特異性受體確認及其結合親和力測定30-31
• 3.2 α-MMC受體介導內吞實驗31-33
• 3.3 α-MMC受體介導內吞阻滯實驗33-37
• 4 實驗結果37-46
• 4.1 放射性配體結合分析37-40
• 4.2 α-MMC進入細胞的圖像40-42
• 4.3 WB法篩選實驗結果42-43
• 4.4 免疫熒光法對siRNA(編號為C)的基因沉默效果再確認43
• 4.5 LRP1基因沉默對α-MMC細胞毒性的抑制作用43-44
• 4.6 LRP1基因沉默對α-MMC內吞入胞的阻滯作用44-46
• 5 討論46-49
• 第三部分 α-MMC受體介導的細胞凋亡信號轉導研究49-56
• 1 引言49
• 2 實驗材料49
• 2.1 試劑及材料49
• 2.2 主要儀器49
• 2.3 主要溶液配置49
• 3 實驗方法49-51
• 3.1 α-MMC細胞凋亡信號轉導實驗49-51
• 3.2 α-MMC細胞凋亡信號轉導阻滯實驗51
• 3.3 數(shù)據處理51
• 4 實驗結果51-54
• 4.1 α-MMC細胞凋亡信號轉導作用51-52
• 4.2 α-MMC細胞凋亡信號轉導阻滯作用52-54
• 5 討論54-56
• 結論56-57
• 參考文獻57-61
• 文獻綜述61-75
• 參考文獻71-75
• 附錄75-77
• 攻讀學位期間的研究成果77-78
• 致謝78

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1 王東生,袁肇凱,郭志華;細胞凋亡與中醫(yī)藥[J];中國中醫(yī)藥信息雜志;2000年12期

2 萬曉艷,于蘇國,郭玉芹,何慶;細胞凋亡與自身免疫性甲狀腺疾病的研究進展[J];中國地方病防治雜志;2002年06期

3 祝偉民,林建棣,馬曉東,段小平;運動與細胞凋亡[J];中國臨床康復;2004年27期

4 王會玲,景文莉,張小紅,高維娟;細胞凋亡與心肌缺血-再灌注損傷[J];承德醫(yī)學院學報;2005年04期

5 梁薇;細胞凋亡的中藥調節(jié)機制[J];四川中醫(yī);2005年11期

6 張松彪;細胞凋亡與細胞養(yǎng)生[J];中國科技產業(yè);2005年01期

7 楊竹林,伍漢文;細胞凋亡調控因素有關基因的研究[J];國外醫(yī)學(生理、病理科學與臨床分冊);1997年02期

8 劉恩梅,楊錫強;細胞凋亡及其影響因素[J];重慶醫(yī)學;1998年01期

9 ;美開發(fā)調控細胞凋亡藥物[J];中國腫瘤;1999年07期

10 管孝鞠,廖明陽;細胞凋亡在致畸中的作用[J];衛(wèi)生毒理學雜志;2000年02期

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1 陳穎麗;李前忠;;不同亞細胞位置的細胞凋亡蛋白質的結構特性分析[A];第十一次中國生物物理學術大會暨第九屆全國會員代表大會摘要集[C];2009年

2 孫英麗;趙允;朱山;翟中和;;植物細胞凋亡及其機理的研究[A];中國細胞生物學學會第七次會議論文摘要匯編[C];1999年

3 劉二龍;袁慧;;鋅與細胞凋亡[A];2003全國家畜內科學學術研討會論文專輯[C];2003年

4 邱潔;高海青;;鋅在細胞凋亡中的作用研究進展[A];山東省微量元素科學研究會第三屆學術研討會論文匯編[C];2006年

5 俞雅萍;;細胞凋亡的機制及途徑和影響因素[A];華東六省一市生物化學與分子生物學學會2006年學術交流會論文集[C];2006年

6 于青;袁偉杰;姚建;;晚期糖基化終末產物引起足細胞凋亡的機制[A];2007年浙滬兩地腎臟病學術年會資料匯編[C];2007年

7 季宇彬;尹立;汲晨鋒;;調控細胞凋亡的線粒體因素[A];腫瘤病因學研究與中西醫(yī)結合腫瘤綜合診療交流研討會論文集[C];2009年

8 吳經緯;湯長發(fā);;運動中細胞凋亡的線粒體變化特征[A];湖南省生理科學會2006年度學術年會論文摘要匯編[C];2007年

9 蒲小平;李長齡;屠鵬飛;宋志宏;;中藥肉叢蓉成分抗神經細胞凋亡的實驗研究[A];第七屆全國生化藥理學術討論會論文摘要集[C];2000年

10 江鍵;宋誠榮;崔黎麗;方影;王小平;;靜電場對細胞凋亡作用的初步探討[A];中國物理學會第九屆靜電學術年會論文集[C];2000年

中國重要報紙全文數(shù)據庫 前10條

1 商東;“細胞凋亡”與臨床醫(yī)學[N];中國醫(yī)藥報;2001年

2 張志軍;細胞凋亡與中醫(yī)藥[N];中國醫(yī)藥報;2002年

3 ;“細胞凋亡療法”正逐步成為治療癌癥的新途徑[N];中國高新技術產業(yè)導報;2002年

4 記者張建松;治療癌癥新途徑：細胞凋亡療法[N];科技日報;2002年

5 李明輝;“細胞凋亡”治癌癥[N];醫(yī)藥導報;2002年

6 洪敏;細胞凋亡研究引人關注[N];中國醫(yī)藥報;2008年

7 陶春祥;細胞凋亡對心臟疾病的影響[N];中國醫(yī)藥報;2003年

8 本報實習記者 梁媛媛;薛定：發(fā)現(xiàn)癌癥“開關”[N];北京科技報;2010年

9 高書明;誘導癌細胞凋亡[N];中國醫(yī)藥報;2004年

10 勇匯;中藥誘導癌細胞凋亡研究進展[N];中國醫(yī)藥報;2002年

中國博士學位論文全文數(shù)據庫 前10條

1 楊利;系列多氮類化合物的抗腫瘤活性研究[D];武漢大學;2012年

2 張浩;從分子、細胞和動物水平研究鉛誘發(fā)氧化損傷及細胞凋亡的效應與機理[D];山東大學;2015年

3 何欣怡;家蠶微孢子蟲（Nosema bombycis）抑制家蠶BmN細胞凋亡的功能研究[D];浙江大學;2015年

4 馮全服;從線粒體途徑研究川芎嗪誘導HepG2細胞凋亡效應機制[D];南京中醫(yī)藥大學;2015年

5 張曉倩;高糖誘導Bim蛋白高表達而促腎近曲小管上皮細胞凋亡的機制探討[D];山東大學;2015年

6 孫健瑋;PTEN基因負調控Raf1磷酸化的作用及其對PC3細胞凋亡的影響[D];昆明醫(yī)科大學;2014年

7 徐林艷;腫瘤細胞凋亡過程中TNFRSF10B和CFLAR調控機制研究[D];山東大學;2015年

8 樊慶端;生物調控網絡的建模與動力學行為研究[D];上海大學;2015年

9 王德選;WNK_3對鈉氯協(xié)調轉運子的調節(jié)及在胚腎細胞凋亡中的保護作用[D];南方醫(yī)科大學;2015年

10 葉嘉;Nogo-B在急性肺損傷肺泡上皮細胞凋亡中的作用[D];第二軍醫(yī)大學;2015年

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1 曹璐璐;2,2’,4,4’-四溴聯(lián)苯醚(BDE-47)對人胚腎細胞(HEK293)的毒理效應及作用機制研究[D];中國科學院煙臺海岸帶研究所;2015年

2 張薇;蒜頭果蛋白誘導HepG-2細胞凋亡的研究[D];云南民族大學;2015年

3 唐建國;視黃醇X受體出核抑制對神經元細胞凋亡的影響[D];福建醫(yī)科大學;2015年

4 安璐;3-氯-1,2-丙二醇細胞毒性及其誘導HEK293細胞凋亡途徑探究[D];江南大學;2015年

5 楊翔;Procaspase-8的異常表達抑制TRAIL誘導腫瘤細胞凋亡[D];昆明理工大學;2015年

6 張昌明;I3C通過調控p53泛素化對喉癌Hep-2細胞凋亡的影響[D];延邊大學;2015年

7 彭涵;共軛亞油酸對仔豬脂肪細胞凋亡的影響[D];西南大學;2015年

8 李立輝;ΔFosB通過MMP-9調控山羊乳腺上皮細胞凋亡的分子機制[D];西北農林科技大學;2015年

9 楊鑫鋮;Hedgehog信號通路在大鼠急性胰腺炎腺泡細胞凋亡中的作用[D];河北醫(yī)科大學;2015年

10 賈瓊瓊;MicroRNA-214對H_2O_2損傷L6骨骼肌成肌細胞增殖和凋亡的影響[D];河北醫(yī)科大學;2015年

，

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