本文關(guān)鍵詞：LRP1介導(dǎo)的α-MMC肝細(xì)胞毒性發(fā)生機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： α-MMC 肝細(xì)胞毒性 LRP1 細(xì)胞凋亡 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)

【摘要】：研究背景α-MMC是從苦瓜籽中提取并分離出的I型核糖體失活蛋白,能失活核糖體而誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞和病毒感染的細(xì)胞凋亡,具有顯著的抗腫瘤、抗病毒等多種藥理活性,但其體內(nèi)應(yīng)用時(shí)也出現(xiàn)了明顯的肝功能異常等細(xì)胞毒性,從而阻止了臨床應(yīng)用。探討α-MMC肝細(xì)胞毒性機(jī)制,以改善毒性并保障安全用藥是發(fā)揮其抗腫瘤作用的前提。研究目的以L02正常肝細(xì)胞株為實(shí)驗(yàn)對(duì)象,探明LRP1介導(dǎo)的α-MMC肝細(xì)胞毒性發(fā)生機(jī)制。材料與方法采用CCK-8試劑檢測α-MMC誘導(dǎo)正常肝細(xì)胞L02、正常乳腺細(xì)胞MCF-10A、正常腎細(xì)胞AD293、正常肺細(xì)胞BEAS-2B的增殖率以計(jì)算各細(xì)胞的半數(shù)抑制率IC50,并對(duì)α-MMC誘導(dǎo)L02細(xì)胞的細(xì)胞凋亡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察及流式細(xì)胞儀檢測凋亡率;之后對(duì)α-MMC進(jìn)行FITC標(biāo)記,于激光共聚焦顯微鏡下觀察FITC-α-MMC進(jìn)入L02、BEAS-2B及AD293的圖像;以放射性配體分析實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證α-MMC的細(xì)胞膜受體并計(jì)算受體密度及結(jié)合親和力;最后以siRNA法沉默L02細(xì)胞上的LRP1蛋白表達(dá),觀察α-MMC的細(xì)胞毒效果及在不同時(shí)間點(diǎn)對(duì)早期凋亡蛋白的誘導(dǎo)作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果(1)α-MMC作用于L02、BEAS-2B、MCF-7、MCF-10A、AD293細(xì)胞的IC50分別為5.077±1.03μg/ml、15.03±2.26μg/ml、30.19±2.45μg/ml、77.43±2.54μg/ml和104.9±4.73μg/ml。α-MMC能明顯誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。(2)激光共聚焦顯微鏡術(shù)可觀察到α-MMC在4h后可進(jìn)入L02、BEAS-2B、AD293細(xì)胞。在L02細(xì)胞內(nèi)其熒光強(qiáng)度最強(qiáng),BEAS-2B細(xì)胞次之,AD293細(xì)胞最弱。2倍摩爾量的α2-M能明顯減弱FITC-α-MMC在L02細(xì)胞中的亮度。(3)放射性配體結(jié)合分析可看到α-MMC與L02細(xì)胞的特異性結(jié)合,其親和力Kd值為47.1±7.54 nM/L,L02、BEAS-2B和AD293細(xì)胞的受體密度分別為14260.7±1422.8個(gè)/cell、7823±447.5個(gè)/cell和872±91個(gè)/cell。(4)對(duì)L02細(xì)胞的LRP1進(jìn)行基因沉默(siRNA)后,其α-MMC的IC50升高為173.6±3.79μg/ml,α-MMC細(xì)胞進(jìn)入量也明顯減少。α-MMC作用于L02細(xì)胞后,凋亡蛋白JNK、Bad蛋白、P53蛋白和活化Caspase9蛋白被激活而明顯升高,而經(jīng)siRNA處理后,JNK、Bad、Active Caspase9和P53信號(hào)蛋白的活化被顯著抑制。結(jié)論α-MMC對(duì)體外培養(yǎng)的肝細(xì)胞L02有較強(qiáng)的細(xì)胞毒性,這種毒性作用是通過誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡達(dá)到的;α-MMC可通過與細(xì)胞膜特異性受體LRP1結(jié)合而被介導(dǎo)入胞,該受體密度越高,α-MMC進(jìn)入細(xì)胞的量就越多,對(duì)細(xì)胞的毒性也越大;α-MMC也可以通過LRP1介導(dǎo)的JNK信號(hào)通路誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。由此我們推導(dǎo)出α-MMC的肝細(xì)胞毒性機(jī)制,即通過LRP1受體介導(dǎo)的α-MMC內(nèi)吞和JNK信號(hào)傳到通路兩條途徑誘導(dǎo)肝細(xì)胞凋亡,從而導(dǎo)致肝細(xì)胞死亡。
【關(guān)鍵詞】：α-MMC 肝細(xì)胞毒性 LRP1 細(xì)胞凋亡 信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)
【學(xué)位授予單位】：成都醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-13
• 第一部分 α-MMC對(duì)肝細(xì)胞的毒性作用及其機(jī)制13-27
• 1 引言13
• 2 實(shí)驗(yàn)材料13-16
• 2.1 實(shí)驗(yàn)藥品、細(xì)胞株及試劑13-14
• 2.2 主要儀器14-15
• 2.3 主要配置溶液15-16
• 3 實(shí)驗(yàn)方法16-20
• 3.1 細(xì)胞凍存16-17
• 3.2 細(xì)胞復(fù)蘇17
• 3.3 細(xì)胞培養(yǎng)與傳代17-18
• 3.4 細(xì)胞計(jì)數(shù)18
• 3.5 蛋白濃度測定18
• 3.6 SDS-PAGE及銀染18-19
• 3.7 細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)19
• 3.8 L02細(xì)胞凋亡實(shí)驗(yàn)19-20
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果20-25
• 4.1 α-MMC銀染染色結(jié)果圖20-21
• 4.2 蛋白濃度測定21-22
• 4.3 α-MMC的細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-23
• 4.4 細(xì)胞凋亡形態(tài)學(xué)觀察23-24
• 4.5 流式細(xì)胞儀測定細(xì)胞凋亡率24-25
• 5 討論25-27
• 第二部分 α-MMC受體介導(dǎo)的內(nèi)吞途徑研究及其受體確認(rèn)27-49
• 1 引言27
• 2 實(shí)驗(yàn)材料27-30
• 2.1 試劑27-29
• 2.2 主要儀器29
• 2.3 主要配置溶液29-30
• 3 實(shí)驗(yàn)方法30-37
• 3.1 α-MMC細(xì)胞膜特異性受體確認(rèn)及其結(jié)合親和力測定30-31
• 3.2 α-MMC受體介導(dǎo)內(nèi)吞實(shí)驗(yàn)31-33
• 3.3 α-MMC受體介導(dǎo)內(nèi)吞阻滯實(shí)驗(yàn)33-37
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-46
• 4.1 放射性配體結(jié)合分析37-40
• 4.2 α-MMC進(jìn)入細(xì)胞的圖像40-42
• 4.3 WB法篩選實(shí)驗(yàn)結(jié)果42-43
• 4.4 免疫熒光法對(duì)siRNA(編號(hào)為C)的基因沉默效果再確認(rèn)43
• 4.5 LRP1基因沉默對(duì)α-MMC細(xì)胞毒性的抑制作用43-44
• 4.6 LRP1基因沉默對(duì)α-MMC內(nèi)吞入胞的阻滯作用44-46
• 5 討論46-49
• 第三部分 α-MMC受體介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)研究49-56
• 1 引言49
• 2 實(shí)驗(yàn)材料49
• 2.1 試劑及材料49
• 2.2 主要儀器49
• 2.3 主要溶液配置49
• 3 實(shí)驗(yàn)方法49-51
• 3.1 α-MMC細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)實(shí)驗(yàn)49-51
• 3.2 α-MMC細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯實(shí)驗(yàn)51
• 3.3 數(shù)據(jù)處理51
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-54
• 4.1 α-MMC細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用51-52
• 4.2 α-MMC細(xì)胞凋亡信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)阻滯作用52-54
• 5 討論54-56
• 結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 文獻(xiàn)綜述61-75
• 參考文獻(xiàn)71-75
• 附錄75-77
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果77-78
• 致謝78

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