本文關(guān)鍵詞：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞定位修復(fù)四氯化碳誘導(dǎo)小鼠肝損傷的研究

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【摘要】：肝臟是人體內(nèi)功能最多的代謝和解毒器官,具有多種生理功能參與體內(nèi)消化、代謝、解毒和免疫等過(guò)程,因此,肝臟損傷可引起動(dòng)物和人體的衰老病變和其他疾病的發(fā)生。目前,嚴(yán)重的肝臟疾病目前還沒(méi)有找到一種完全能治愈的措施和治療方法。由于干細(xì)胞具有自我更新和多向分化潛能,有望為干細(xì)胞移植性治療提供新來(lái)源,是病變組織器官損傷修復(fù)的理想首選細(xì)胞。近幾年研究者們主要將目光集中在胎盤(pán)來(lái)源的羊膜組織上,不僅其獲得取材方便、來(lái)源廣泛、增殖能力強(qiáng)、免疫原性低,最重要是不受醫(yī)學(xué)倫理道德限制的優(yōu)點(diǎn),這也是比胚胎干細(xì)胞應(yīng)用更廣泛的主要原因。羊膜包含兩種細(xì)胞即人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞和羊膜上皮細(xì)胞,其中人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞(human amnion mesenchymal cells, hAMSCs)起源中胚層屬于成體干細(xì)胞,具備間充質(zhì)干細(xì)胞特性同時(shí)還具有胚胎干細(xì)胞特性,此外hAMSCs還具有在體外特定條件下向內(nèi)、中、外三個(gè)胚層分化潛能,是干細(xì)胞移植和再生醫(yī)學(xué)的種子細(xì)胞。1、經(jīng)過(guò)胰蛋白酶和Ⅰ型膠原酶共同消化羊膜組織獲得hAMSCs,培養(yǎng)并觀察細(xì)胞生長(zhǎng)特性、形態(tài)特征、解析分裂中期的染色體；再通過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)、二氨基聯(lián)苯胺(Diaminobenzidine Staining, DAB)染色、免疫熒光染色、流式細(xì)胞術(shù)分析表面抗原、定向誘導(dǎo)三胚層分化和RT-PCR檢測(cè)等方法對(duì)培養(yǎng)的細(xì)胞進(jìn)行鑒定。試驗(yàn)結(jié)果表明,從人羊膜組織中分離得到純度很高的間充質(zhì)干細(xì)胞,經(jīng)過(guò)免疫組化波形絲蛋白(vimentin) DAB染色呈現(xiàn)淺紅色陽(yáng)性表達(dá)；免疫熒光檢測(cè)表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞表面標(biāo)記Vimentin和胚胎干細(xì)胞表面標(biāo)記SSEA-4;流式細(xì)胞術(shù)測(cè)定細(xì)胞強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)間質(zhì)細(xì)胞表面抗原CD29、CD49d、CD73,不表達(dá)造血干細(xì)胞表面抗原CD34、CD45和人白細(xì)胞免疫抑制因子HLA-DR;經(jīng)過(guò)免疫細(xì)胞化學(xué)RT-PCR檢測(cè)在體外特定條件下可成功誘導(dǎo)分化為脂肪細(xì)胞、成骨細(xì)胞、神經(jīng)樣細(xì)胞和胰島樣細(xì)胞。結(jié)果表明hAMSCs可在體外成功分離、純化、增殖培養(yǎng)并保持穩(wěn)定的遺傳和生物特性,還具有體外三胚層分化潛能。2、以四氯化碳(CCL4)誘導(dǎo)小鼠肝損傷為受試模型,將活體染料Dir和羧基熒光素乙酰乙酸(CFSE)標(biāo)記的hAMSCs通過(guò)尾靜脈注射移植到肝損傷小鼠,觀察hAMSCs在小鼠體內(nèi)遷移歸巢情況及移植后治療效果。結(jié)果表明成功建立小鼠肝損傷模型,Dir和CFSE標(biāo)記hAMSCs分別通過(guò)活體成像和冰凍切片免疫熒光觀察移植hAMSCs可以遷移歸巢到受損的肝臟,iAMSCs移植后對(duì)受損小鼠肝功、組織病理學(xué)以及分泌白蛋白等方面都有修復(fù)作用,肝損傷程度明顯改善,治療效果顯著。3、實(shí)時(shí)熒光定量和蛋白印跡技術(shù)檢測(cè)表明hAMSCs移植后可提高受損肝組織中肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子(HGF)和沉默信息調(diào)節(jié)因子1 (SIRT-1)的表達(dá),抑制α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)和周期性蛋白依賴性激酶抑制因子(P27kip1)的表達(dá),這些基因參與調(diào)控肝細(xì)胞增殖、再生,細(xì)胞凋亡等方面,抑制肝纖維化過(guò)程,因此,α-SMA、HGF、SIRT-1、P27kip1可能是肝再生過(guò)程中關(guān)鍵基因,且hAMSCs移植后改善CCL4誘導(dǎo)的肝纖維化,抑制細(xì)胞凋亡,促進(jìn)肝細(xì)胞有絲分裂,對(duì)肝損傷有一定的修復(fù)作用,為進(jìn)一步探索調(diào)控肝再生、損傷修復(fù)信號(hào)通路(機(jī)制)及預(yù)防肝纖維化提供了新的啟示。綜上,hAMSCs可在體外分離培養(yǎng)且具有三胚層分化潛能；經(jīng)過(guò)標(biāo)記的hAMSCs能夠遷移歸巢到受損肝臟組織,并能通過(guò)參與調(diào)控肝細(xì)胞相關(guān)基因?qū)Ω螕p傷有一定的修復(fù)作用,為治療肝損傷疾病等方面提供實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)和臨床依據(jù)。
【關(guān)鍵詞】：人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞 肝損傷 定位修復(fù) 四氯化碳 小鼠
【學(xué)位授予單位】：內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575
【目錄】：

• 摘要3-5
• Abstract5-14
• 1 引言14-25
• 1.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞研究現(xiàn)狀14-20
• 1.1.1 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的分離培養(yǎng)14-16
• 1.1.2 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)和免疫表型16
• 1.1.3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)分化體系16-18
• 1.1.4 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體內(nèi)誘導(dǎo)分化體系18
• 1.1.5 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞免疫原性及免疫調(diào)控功能18-20
• 1.2 干細(xì)胞治療肝臟疾病研究進(jìn)展20-23
• 1.2.1 四氯化碳與肝損傷20
• 1.2.2 干細(xì)胞治療肝臟疾病研究現(xiàn)狀20-21
• 1.2.3 肝損傷修復(fù)機(jī)理的研究21-22
• 1.2.4 移植細(xì)胞動(dòng)物實(shí)驗(yàn)是否可歸巢到損傷肝臟22
• 1.2.5 間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)肝損傷動(dòng)物模型療效評(píng)估22-23
• 1.3 本研究的目的和意義23-24
• 1.4 技術(shù)路線24-25
• 2 實(shí)驗(yàn)一 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞體外分離培養(yǎng)及誘導(dǎo)分化25-48
• 2.1 材料與方法25-30
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)材料25
• 2.1.2 儀器設(shè)備25
• 2.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑25-26
• 2.1.4 實(shí)驗(yàn)方法26-30
• 2.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果30-45
• 2.2.1 不同濃度Ⅰ型膠原酶消化分離人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)比較30-32
• 2.2.2 比較不同凍存液對(duì)人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞復(fù)蘇效果32-33
• 2.2.3 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞的生長(zhǎng)曲線33-34
• 2.2.4 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞染色體數(shù)目分析34-35
• 2.2.5 流式細(xì)胞儀檢測(cè)標(biāo)記抗原35-37
• 2.2.6 免疫細(xì)胞化學(xué)染色37-38
• 2.2.7 免疫熒光檢測(cè)表面標(biāo)記蛋白38-39
• 2.2.8 向脂肪細(xì)胞誘導(dǎo)分化及鑒定39-40
• 2.2.9 向成骨細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定40-41
• 2.2.10 向神經(jīng)細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定41-43
• 2.2.11 向胰島樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化鑒定43-44
• 2.2.12 RT-PCR檢測(cè)hAMSCs誘導(dǎo)后細(xì)胞44-45
• 2.3 討論45-47
• 2.4 小結(jié)47-48
• 3 實(shí)驗(yàn)二 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞定位修復(fù)小鼠肝損傷模型48-62
• 3.1 材料與方法48-52
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)材料48
• 3.1.2 儀器設(shè)備48-49
• 3.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑49
• 3.1.4 實(shí)驗(yàn)方法49-52
• 3.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果52-59
• 3.2.1 移植人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞在小鼠肝臟體內(nèi)示蹤(活體成像)52-54
• 3.2.2 CFSE標(biāo)記人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞結(jié)果54
• 3.2.3 小鼠肝損傷模型的建立54-55
• 3.2.4 比較hAMSCs移植前后小鼠肝組織病理學(xué)變化55-56
• 3.2.5 hAMSCs移植前后小鼠肝功能變化56-58
• 3.2.6 CFSE標(biāo)記的hAMSCs的肝內(nèi)分布定植58-59
• 3.2.7 免疫熒光檢測(cè)細(xì)胞移植后小鼠肝Alb的表達(dá)59
• 3.3 討論59-61
• 3.4 小結(jié)61-62
• 4 實(shí)驗(yàn)三 人羊膜間充質(zhì)干細(xì)胞移植促進(jìn)肝損傷修復(fù)的作用與機(jī)制62-76
• 4.1 材料與方法62-67
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)材料62
• 4.1.2 儀器設(shè)備62
• 4.1.3 實(shí)驗(yàn)試劑62-63
• 4.1.4 實(shí)驗(yàn)方法63-67
• 4.2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果67-73
• 4.2.1 RT-PCR檢測(cè)HGF、SIRT-1、α-SMA、P~(27kip1)mRNA表達(dá)67-68
• 4.2.2 RT-qPCR產(chǎn)物特異性檢測(cè)68-71
• 4.2.3 RT-qPCR檢測(cè)相對(duì)定量結(jié)果71-72
• 4.2.4 Western blot檢測(cè)72-73
• 4.3 討論73-75
• 4.4 小結(jié)75-76
• 5 結(jié)論76-77
• 致謝77-78
• 參考文獻(xiàn)78-88
• 作者簡(jiǎn)介88

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：976870