本文關(guān)鍵詞：PIK3R3在肝臟脂肪代謝中的作用及其機(jī)制研究

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【摘要】：[目的]本實(shí)驗(yàn)室長期從事磷脂酰肌醇3-激酶(Phosphatidylinositol3-kinase, PI3K)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路中關(guān)于調(diào)節(jié)亞基PIK3R3功能的相關(guān)研究,前期研究證明PIK3R3在細(xì)胞多種病理生理下發(fā)揮重要作用,如在白血病細(xì)胞中阻斷PIK3R3可抑制白血病細(xì)胞的增殖、促進(jìn)其分化,PIK3R3可與視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤蛋白(retinoblastoma protein, RB)及細(xì)胞增殖核抗原(proliferation cell nuclear antigen, PCNA)相結(jié)合進(jìn)而調(diào)控腫瘤細(xì)胞的增殖,而且PIK3R3可以通過非AKT依賴性途徑激活NFκB信號(hào)通路,參與結(jié)直腸癌的血管生成。但PIK3R3作為P13K信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路重要的調(diào)節(jié)亞基,是否參與脂質(zhì)代謝,及在脂質(zhì)代謝中的作用尚不明了。本部分研究旨在明確PIK3R3在肝臟脂質(zhì)代謝中的作用。 [方法]首先,我們利用既往文獻(xiàn)報(bào)道的肝臟脂質(zhì)代謝的動(dòng)物模型,通過高脂飼料喂養(yǎng)造成小鼠的脂肪肝模型,以及饑餓再喂養(yǎng)模型,應(yīng)用WB及QPCR分別檢測(cè)小鼠肝臟中P13K各種不同催化亞基及調(diào)節(jié)亞基蛋白表達(dá)及mRNA水平的變化。然后,我們?cè)诟咧嬍持靖文Ｐ偷幕A(chǔ)上,利用本實(shí)驗(yàn)室前期構(gòu)建的PIK3R3過表達(dá)腺病毒及PIK3R3特異性的siRNA通過尾靜脈注射入小鼠體內(nèi),觀察上調(diào)或下調(diào)PIK3R3表達(dá)對(duì)于肝臟脂肪代謝的影響。最后在體外實(shí)驗(yàn)中,利用人正常肝細(xì)胞作為實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?通過轉(zhuǎn)染PIK3R3過表達(dá)質(zhì)粒及特異性的siRNA,觀察干預(yù)PIK3R3的表達(dá)對(duì)正常肝細(xì)胞酮體生成的影響。 [結(jié)果]我們通過高脂飲食喂養(yǎng)成功建立了小鼠的脂肪肝動(dòng)物模型,表現(xiàn)為肝臟體積增大、重量增加,肝臟表面呈灰白色,HE染色可見肝小葉內(nèi)散在分布空泡,油紅O染色可見大量脂滴分布,這些均與既往文獻(xiàn)報(bào)道的結(jié)果相一致。我們收集建模過程中不同時(shí)間段的小鼠肝臟,發(fā)現(xiàn)隨著高脂飲食時(shí)間的延長,脂肪肝程度的加重,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表達(dá)均逐漸降低,而P13K其他催化亞基和調(diào)節(jié)亞基并無明顯變化。而在饑餓再喂養(yǎng)模型中,我們發(fā)現(xiàn)小鼠饑餓24小時(shí)后,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表達(dá)明顯增高,而饑餓后再給以飼料喂養(yǎng)24小時(shí)后,PIK3R3的mRNA水平及蛋白表達(dá)又恢復(fù)至本底水平,這提示PIK3R3可能參與肝臟脂肪代謝；而同時(shí)P13K其他催化亞基和調(diào)節(jié)亞基并無明顯變化,提示PIK3R3可能區(qū)別于其他亞基,在脂肪代謝中有其獨(dú)特的作用。進(jìn)而,我們?cè)诟咧嬍车闹靖蝿?dòng)物模型中干預(yù)PIK3R3的表達(dá),發(fā)現(xiàn)過表達(dá)PIK3R3可緩解小鼠的脂肪肝表型,而沉默PIK3R3則加重了小鼠的脂肪肝。繼而在體外細(xì)胞水平的實(shí)驗(yàn)結(jié)果也與小鼠體內(nèi)實(shí)驗(yàn)相吻合,即PIK3R3對(duì)肝細(xì)胞酮體生成有顯著的影響。 [結(jié)論]高脂飲食及饑餓再喂養(yǎng)等飲食因素可影響PIK3R3的mRNA水平及蛋白表達(dá),而對(duì)P13K其他催化亞基或調(diào)節(jié)亞基的影響不大,提示PIK3R3區(qū)別于其他亞基,在肝臟脂肪代謝中有其獨(dú)特的作用；在小鼠的脂肪肝動(dòng)物模型中干預(yù)PIK3R3的表達(dá),可調(diào)控小鼠的脂肪肝表型,同時(shí)在人正常肝細(xì)胞中也可調(diào)控酮體生成能力,影響肝細(xì)胞的脂肪代謝。 [目的]在前一部分研究中,我們利用高脂飲食的小鼠脂肪肝模型,發(fā)現(xiàn)PIK3R3可能參與肝臟脂肪代謝,干預(yù)PIK3R3的表達(dá)能夠影響小鼠肝臟及人正常肝細(xì)胞的脂肪代謝,但PIK3R3調(diào)控脂肪代謝的機(jī)制尚不明確。過氧化物酶體增殖物激活受體家族(peroxisome proliferators-activated receptors, PPARs)作為一種配體激活型的核受體,在脂質(zhì)代謝中起到關(guān)鍵的中樞調(diào)控作用,而其中的PPARa (PPARA)亞型主要表達(dá)于肝臟組織中,可調(diào)控多種代謝關(guān)鍵酶的表達(dá),尤其對(duì)脂肪酸分解代謝產(chǎn)生影響,而我們前期實(shí)驗(yàn)觀察到,PIK3R3可以調(diào)控ACADM及CPT1A的mRNA水平和蛋白表達(dá),這兩個(gè)關(guān)鍵酶亦受到PPARA的調(diào)控。因此,我們提出科學(xué)假設(shè),PIK3R3是否依賴于PPARA調(diào)控肝臟脂肪代謝,本部分研究旨在闡明PIK3R3調(diào)控肝臟脂肪代謝的潛在機(jī)制。 [方法]我們?cè)谌苏８渭?xì)胞L02及Chang liver中,通過轉(zhuǎn)染PIK3R3過表達(dá)質(zhì)粒及特異性的siRNA,干預(yù)PIK3R3的表達(dá),利用WB及QPCR技術(shù)分別檢測(cè)PPARA及PPARG兩個(gè)基因蛋白表達(dá)及mRNA水平的變化。繼而我們利用前一部分中高脂飲食及饑餓再喂養(yǎng)的動(dòng)物模型樣本,檢測(cè)PPARA蛋白表達(dá)及mRNA水平的變化。進(jìn)而利用第一部分中干預(yù)PIK3R3表達(dá)后小鼠的肝臟標(biāo)本,通過免疫組織染色法、WB及QPCR檢測(cè)其中PPARA蛋白表達(dá)及mRNA水平的變化。最后分別在體內(nèi)及體外實(shí)驗(yàn)中干預(yù)PPARA的表達(dá),觀察其對(duì)PIK3R3調(diào)控脂肪代謝作用的影響。 [結(jié)果]在人正常肝細(xì)胞L02及Chang liver過表達(dá)PIK3R3可明顯促進(jìn)PPARA的蛋白表達(dá)及mRNA水平,沉默PIK3R3可明顯抑制PPARA的蛋白表達(dá)及mRNA水平,而對(duì)PPARG的蛋白表達(dá)及mRNA水平?jīng)]有明顯影響。利用論文第一部分實(shí)驗(yàn)中高脂飲食及饑餓再喂養(yǎng)的動(dòng)物模型樣本檢測(cè)PPARA,發(fā)現(xiàn)PPARA的蛋白表達(dá)及mRNA水平隨著高脂飲食時(shí)間的延長而逐漸降低,饑餓條件下小鼠肝臟內(nèi)PPARA的蛋白表達(dá)及mRNA水平明顯升高,而饑餓后再給以喂食可恢復(fù)至正常喂養(yǎng)時(shí)的水平,這提示PPARA的表達(dá)受到不同飲食條件的調(diào)節(jié),并且與前文發(fā)現(xiàn)的PIK3R3受飲食條件調(diào)節(jié)的變化趨勢(shì)一致。而在干預(yù)PIK3R3表達(dá)后,PPARA的表達(dá)隨之變化;最后在干預(yù)PIK3R3的同時(shí)也干預(yù)PPARA的表達(dá),可逆轉(zhuǎn)PIK3R3對(duì)脂肪代謝的調(diào)控作用。 [結(jié)論]PIK3R3可以調(diào)控人正常肝細(xì)胞及小鼠肝臟的脂肪分解代謝,而這種調(diào)控作用是通過調(diào)控PPARA這一脂質(zhì)代謝關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的,干預(yù)PPARA的表達(dá)可逆轉(zhuǎn)PIK3R3對(duì)脂肪代謝的調(diào)控作用。 [目的]前面兩部分研究表明PIK3R3可以調(diào)控肝臟脂肪代謝,并且其調(diào)控功能是依賴于對(duì)PPARa(PPARA)的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)的,但PIK3R3調(diào)控PPARa的機(jī)制尚不明確,本部分內(nèi)容旨在探索其中的具體分子機(jī)制。 [方法]通過加入CHX(Cycloheximide,放線菌酮)或MG132(Proteasome抑制劑),分別抑制肝細(xì)胞的蛋白合成及蛋白降解,觀察是否可以影響PIK3R3對(duì)PPARa蛋白表達(dá)的調(diào)控作用,從而明確PIK3R3是如何調(diào)控PPARa表達(dá)的。進(jìn)而構(gòu)建了PPARa的啟動(dòng)子熒光素酶質(zhì)粒,觀察PIK3R3對(duì)PPARa啟動(dòng)子活性的影響。既往文獻(xiàn)報(bào)道PPARa的轉(zhuǎn)錄調(diào)控主要受到HNF4a(hepatic nuclear factor4a,肝核因子4a)及NR2F2(nuclear receptor subfamily2group F member2,核受體亞家族成員2F組2)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié),我們通過QPCR及WB檢測(cè)PIK3R3對(duì)這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄因子表達(dá)的影響。接下來我們利用肝細(xì)胞L02行染色質(zhì)免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation, ChIP),應(yīng)用QPCR及PCR產(chǎn)物瓊脂糖電泳技術(shù),觀察過表達(dá)或沉默PIK3R3后HNF4a(HNF4A)結(jié)合于PPARa啟動(dòng)子能力的變化。我們?cè)诟渭?xì)胞L02中同時(shí)干預(yù)PIK3R3及HNF4A的表達(dá),觀察HNF4A是否可以介導(dǎo)及阻斷PIK3R3對(duì)PPARa蛋白表達(dá)及mRNA水平的影響。在肝細(xì)胞中加入AKT抑制劑SH-6或轉(zhuǎn)染AKT特異性的siRNA,觀察PIK3R3調(diào)控HNF4A和PPARa是否依賴于經(jīng)典的AKT信號(hào)通路。而既往研究表明PIK3R3可與BRGl (Brahma-related genel, Brahma相關(guān)基因1)結(jié)合并定位于細(xì)胞核內(nèi),BRG1是SWI/SNF染色質(zhì)重塑復(fù)合物家族的一員,可以影響HNF4A的轉(zhuǎn)錄活性。因此我們通過蛋白免疫共沉淀(Co immunoprecipitation, Co-IP)及熒光共定位技術(shù)檢測(cè)PIK3R3是否可以與BRGl相結(jié)合,利用ChIP技術(shù)檢測(cè)BRG1是否結(jié)合于HNF4A的啟動(dòng)子區(qū)域,并且這種結(jié)合是否受到PIK3R3過表達(dá)或沉默的影響。最后在細(xì)胞中通過轉(zhuǎn)染BRG1特異性siRNA沉默BRG1及利用BRG1突變的細(xì)胞系檢測(cè)PIK3R3是否依賴BRG1調(diào)控HNF4A及PPARa的表達(dá)。 [結(jié)果]肝細(xì)胞中加入MG132對(duì)PIK3R3調(diào)控PPARa蛋白表達(dá)的作用沒有明顯影響,而加入CHX可阻斷PIK3R3對(duì)PPARa的調(diào)控作用；過表達(dá)PIK3R3可促進(jìn)PPARa的啟動(dòng)子活性,而沉默PIK3R3可抑制PPARa的啟動(dòng)子活性。PIK3R3可調(diào)控HNF4A的mRNA水平及蛋白表達(dá),但對(duì)NR2F2沒有明顯影響,而進(jìn)一步PIK3R3可影響HNF4A結(jié)合于PPARa啟動(dòng)子的能力,干預(yù)HNF4A的表達(dá)可阻斷PIK3R3對(duì)PPARa mRNA水平及蛋白表達(dá)的影響,AKT抑制劑及特異性siRNA不能阻斷PIK3R3對(duì)HNF4A及PPARa的影響。Co-IP及熒光共定位實(shí)驗(yàn)證實(shí)PIK3R3與BRG1結(jié)合并濃聚于細(xì)胞核內(nèi),干預(yù)PIK3R3可影響B(tài)RG1與HNF4A啟動(dòng)子結(jié)合的能力。而在BRG1沉默或缺失的條件下,PIK3R3失去調(diào)控HNF4A及PPARa的能力。 [結(jié)論]PIK3R3通過影響PPARa的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)其蛋白表達(dá),PIK3R3調(diào)控PPARa依賴于HNF4A,但不依賴于經(jīng)典的AKT信號(hào)通路。PIK3R3可與BRG1結(jié)合從而影響HNF4A的轉(zhuǎn)錄活性并調(diào)控PPARa的表達(dá)。 [目的]前三部分的研究闡述了PIK3R3在肝臟脂肪代謝中的作用,提示PIK3R3可以通過調(diào)控PPARA的表達(dá),從而影響正常肝臟細(xì)胞的脂肪分解代謝,而既往研究表明PIK3R3在包括卵巢癌、結(jié)腸癌、肝細(xì)胞癌等多種腫瘤中呈異常過表達(dá),且PPARA因其可促進(jìn)脂肪分解為細(xì)胞供能,可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖、抑制細(xì)胞凋亡,被認(rèn)為具有癌基因的特征。我們前期的結(jié)果證實(shí),在結(jié)腸癌中PIK3R3也可促進(jìn)PPARA的表達(dá),那么在肝癌中PIK3R3和PPARA兩者的表達(dá)是否也存在一定的相關(guān)性,PIK3R3在肝癌中的作用是否也依賴于PPARA。本部分研究旨在明確在肝癌中,PIK3R3與PPARA的相關(guān)性,及PIK3R3調(diào)控肝癌細(xì)胞脂肪代謝的能力是否依賴于PPARA。 [方法]我們通過在肝癌細(xì)胞HepG2及SMMC-7721中轉(zhuǎn)染PIK3R3過表達(dá)質(zhì)粒及特異性siRNA,干預(yù)PIK3R3的表達(dá),進(jìn)一步通過WB檢測(cè)PPARA及PPARA上游轉(zhuǎn)錄因子HNF4A的蛋白表達(dá)水平,通過試劑盒法檢測(cè)肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中酮體的含量,觀察在肝癌細(xì)胞中PIK3R3是否可以調(diào)控PPARA的表達(dá),及PIK3R3對(duì)脂肪代謝的影響。進(jìn)而我們利用CCK8法及BrdU\PI雙摻入法檢測(cè)肝癌細(xì)胞的增殖及DNA合成速度,觀察干預(yù)PIK3R3的表達(dá)是否可以調(diào)控肝癌細(xì)胞的增殖,我們同時(shí)還應(yīng)用既往構(gòu)建的PIK3R3過表達(dá)及沉默慢病毒,感染肝癌細(xì)胞,藥物篩選得到PIK3R3穩(wěn)定過表達(dá)及沉默的細(xì)胞株,利用該穩(wěn)定細(xì)胞株行軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)及細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn),觀察PIK3R3對(duì)克隆生長及侵襲轉(zhuǎn)移。繼而我們?cè)诟深A(yù)PIK3R3表達(dá)的基礎(chǔ)上,同時(shí)干預(yù)PPARA的表達(dá),觀察肝癌細(xì)胞脂肪代謝水平的變化、細(xì)胞增殖能力及遷移能力,從而明確PIK3R3調(diào)控肝癌細(xì)胞脂肪代謝及細(xì)胞增殖是否依賴于PPARA。最后我們?cè)诟伟┘?xì)胞及臨床肝癌標(biāo)本中檢測(cè)PIK3R3及PPARA表達(dá)的相關(guān)性。 [結(jié)果]在兩株肝癌細(xì)胞HepG2及SMMC-7721中干預(yù)PIK3R3的表達(dá),可引起HNF4A及PPARA蛋白表達(dá)水平的變化,即過表達(dá)PIK3R3可促進(jìn)HNF4A及PPARA的表達(dá),而沉默PIK3R3可抑制HNF4A及PPARA的蛋白水平；同時(shí)干預(yù)PIK3R3可影響肝癌細(xì)胞培養(yǎng)基上清中的酮體含量,且與正常肝細(xì)胞LO2、 Chang liver中的結(jié)果相一致。我們同時(shí)也觀察到,過表達(dá)PIK3R3可促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖及侵襲遷移,表現(xiàn)為CCK8實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞吸收值的升高、BrdU\PI實(shí)驗(yàn)中細(xì)胞處于DNA合成期的比例增高,軟瓊脂克隆形成實(shí)驗(yàn)和平板克隆形成實(shí)驗(yàn)中表現(xiàn)為生成克隆的數(shù)目增多、克隆體積增大,以及穿過小室的細(xì)胞增多,細(xì)胞運(yùn)動(dòng)速度加快。而干預(yù)PIK3R3的同時(shí)干預(yù)PPARA,可部分逆轉(zhuǎn)PIK3R3對(duì)肝癌細(xì)胞生成酮體及細(xì)胞增殖的影響,但對(duì)PIK3R3促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移的作用沒有顯著影響。在肝癌細(xì)胞系及臨床肝癌標(biāo)本中PIK3R3與PPARA的表達(dá)具有一定相關(guān)性。 [結(jié)論]PIK3R3與PPARA表達(dá)水平的相關(guān)性及PIK3R3可以調(diào)控PPARA表達(dá)水平的現(xiàn)象,不只限于正常肝細(xì)胞中,在肝癌細(xì)胞及臨床肝癌標(biāo)本中也同樣存在。PIK3R3調(diào)控肝癌細(xì)胞脂肪代謝及增殖的能力可被PPARA部分阻斷,提示PIK3R3促進(jìn)腫瘤發(fā)生發(fā)展的作用有可能與其調(diào)控脂質(zhì)代謝相關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：磷脂酰肌醇3-激酶 PIK3R3 肝臟 脂肪代謝 高脂飲食 PIK3R3 肝臟 脂肪代謝 過氧化物酶體增殖物激活受體α PIK3R3 轉(zhuǎn)錄調(diào)控 肝核因子4α Brahma相關(guān)基因1 過氧化物酶體增生物激活受體α PIK3R3 過氧化物酶體增生物激活受體α 肝癌 增殖
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 華中科技大學(xué)博士學(xué)位論文創(chuàng)新點(diǎn)概述3-9
• 引言9-18
• 參考文獻(xiàn)13-18
• 第一部分：PIK3R3對(duì)肝臟脂肪代謝的影響18-44
• 摘要18-20
• ABSTRACT20-22
• 前言22-23
• 1 材料與方法23-27
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-39
• 3 討論39-41
• 參考文獻(xiàn)41-44
• 第二部分：PIK3R3依賴PPARA調(diào)控肝臟脂肪代謝44-64
• 摘要44-46
• ABSTRACT46-48
• 前言48
• 1 材料與方法48-51
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果51-60
• 3 結(jié)論60-61
• 參考文獻(xiàn)61-64
• 第三部分：PIK3R3調(diào)控PPARA的具體機(jī)制研究64-82
• 摘要64-66
• ABSTRACT66-68
• 前言68
• 1 材料與方法68-70
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果70-79
• 3 討論79
• 參考文獻(xiàn)79-82
• 第四部分：PIK3R3通過PPARA調(diào)控肝癌細(xì)胞脂肪代謝及增殖82-102
• 摘要82-84
• ABSTRACT84-86
• 前言86
• 1 材料與方法86-88
• 2 實(shí)驗(yàn)結(jié)果88-97
• 3 討論97-98
• 參考文獻(xiàn)98-102
• 全文總結(jié)102-104
• 文獻(xiàn)綜述104-129
• 參考文獻(xiàn)114-129
• 縮略詞129-130
• 發(fā)表期刊論文130-131
• 致謝131-132

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本文編號(hào)：976064