本文關鍵詞：凝血酶切割骨橋蛋白在肝纖維化中的作用研究

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【摘要】：研究背景和目的肝臟纖維化是由于包括膠原蛋白在內的細胞外基質(extracellular matrix, ECM)蛋白的過度積累所導致的。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分的慢性肝臟疾病。目前,纖維化被認為是機體的一種應答反應,是機體對慢性肝臟疾病導致的肝臟反復損傷的一個損傷-修復反應,同時伴隨修復和再生的過程。肝星狀細胞(hepatic stellate cells, HSCs)的活化被作為ECM沉積的中心事件。在細胞因子刺激之后,靜止的HSCs增殖并轉分化為具有促炎和促纖維化功能的纖維母細胞樣細胞。而且,活化的HSCs能夠分泌一系列的細胞因子和生長因子,對于維持HSCs的活化狀態(tài)是有利的。在這些細胞因子中,TGF-β是肝臟中最有效的致纖維化的細胞因子,它可以刺激ECM蛋白的合成。目前大量研究證實HSCs的活化和增值大多是TGFβ依賴途徑的。全長OPN (full length OPN, OPN-FL)是一種可溶性的細胞外基質蛋白,也是一種磷酸化糖蛋白。OPN蛋白包含一個經(jīng)典的與細胞表面受體結合的結構域--精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸結構域(arginine-glycine-aspartic acid, RGD),這個結構域能夠被細胞表面的整合素受體αvβ3,αvβ5,α4β1, and α8β1識別。這些識別RGD的整合素可表達于多種細胞表面,包括成纖維細胞、平滑肌細胞、內皮細胞、上皮細胞和免疫細胞。OPN-FL在RGD結構域外臨近的氨基酸序列能夠被凝血酶識別并切割。OPN-FL被凝血酶切割之后稱為凝血酶切割的OPN (Thrombin-cleaved OPN, Thr-OPN),暴露出了一個新的整合素受體結合的位點--SVVYGLR序列(在小鼠中為SLAYGLR),這個位點可以被整合素α4β1和α9β1識別。肝臟纖維化可以發(fā)生在大部分類型的慢性肝臟疾病中,包括慢性乙型病毒(hepatitis B virus, HBV)感染,慢性丙型肝炎病毒(hepatitis C virus, HCV)感染、非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis, NASH).酒精性肝臟疾病(alcoholic liver disease, ALD)和原發(fā)性膽汁性肝硬化(primary biliary cirrhosis, PBC).近來的報道指出血漿OPN-FL在肝纖維化患者中升高,其升高的水平可以用于預測肝硬化的進展,并且OPN-FL能夠誘導HSCs的活化。在動物模型中OPN的缺乏可以保護小鼠抵抗肝臟纖維化進展�？傊�,OPN參與了大部分類型慢性肝臟疾病中肝纖維化的過程。但是由于OPN可以以多種形式存在于細胞內外, 并且能夠與一系列整合素受體結合發(fā)揮生物學作用,具體是哪一種形式的OPN在肝纖維化中發(fā)揮作用,以及通過哪個受體發(fā)揮作用是不清楚的。這些都是亟待解決的。Thr-OPN暴露一個新的整合素結合位點--SVVYGLR(小鼠中為SLAYGLR)序列,能夠促進了表達整合素α4和α9的細胞的粘附。近來的研究表明,Thr-OPN參與了酒精誘導小鼠酒精相關性肝病模型和ConA誘導的小鼠肝炎模型中肝炎的發(fā)病機制。另外,也有研究指出Thr-OPN在心肌纖維化模型中促進了III型膠原蛋白的合成。然而,關于Thr-OPN在人類疾病中的作用研究很少,關于Thr-OPN在肝硬化中的功能亦知之甚少。因此,本文擬研究Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達情況以及是否明顯參與了肝硬化的進展。第一部分：Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達及其對HSCs的活化和功能影響目的：明確Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達情況,探索Thr-OPN對HSCs的活化和功能影響。方法：1)通過收集健康人,慢乙肝患者以及慢乙肝相關肝纖維化患者樣本,通過ELISA方法檢測其主要Thr-OPN、OPN-FL和TGF-β在肝纖維化患者中的表達情況。并分別分析Thr-OPN. OPN-FL和血漿中肝纖維化非侵入性指標(透明質酸,III型前膠原和IV膠原)以及TGF-β之間的相關性2)利用肝星狀細胞株LX2細胞,并通過western blot, PCR, ELISA, MTS和微流控系統(tǒng)等方法研究Thr-OPN對HSCs的活化、增殖、遷移和膠原合成功能影響。結果：1)肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝和健康志愿者。2)肝硬化患者Thr-OPN的表達與血漿中肝纖維化非侵入性指標透明質酸,III型前膠原和IV膠原的水平均呈明顯正相關,也與TGF-p水平呈明顯的正相關。3) Thr-OPN能夠活化HSCs,并促進其自身分泌TGF-p,有利于HSCs活化狀態(tài)的維持,同時能夠增強HSCs膠原生成能力,以及細胞的增殖和遷移能力。和OPN-FL相比,Thr-OPN具有更強的促進HSCs活化、膠原生成、增殖和遷移的能力。第二部分：建立CCl4誘導的小鼠肝纖維化進展模型,證實Thr-OPN參與肝纖維化的進展目的：采用CCl4誘導肝纖維化進展模型,研究Thr-OPN在小鼠肝纖維化模型的表達以及與纖維化發(fā)展之間的關系,證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展。方法：1)建立CCl4誘導小鼠肝纖維化進展模型,首先通過Masson三色染色評估了肝纖維化程度；并通過ELISA方法檢測肝臟組織中Thr-OPN和OPN-FL的表達；肝纖維化進展模型中肝組織HSCs的活化以及膠原合成的相關指標通過western blot, PCR,和免疫組化檢測2)通過western blot, PCR,免疫組化,免疫熒光等方法檢測肝纖維化患者和小鼠的肝臟組織中整合素受體α4和a9的表達情況。并利用肝星狀細胞株LX2細胞,檢測Thr-OPN刺激后肝星狀細胞中整合素受體α4和α9的表達情況。結果：1)在小鼠肝纖維化進展中,Thr-OPN表達水平持續(xù)增高。2)在小鼠肝纖維化進展中,Thr-OPN的表達與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成密切相關。3)肝硬化患者肝臟組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的高表達,在小鼠肝纖維化進展模型中隨著纖維化程度的加重,肝組織中Thr-OPN的整合素受體α4和α9的表達逐漸增加,體外實驗也證實Thr-OPN活化HSCs后同時能夠誘導HSCs高表達其自身受體整合素α4和α9。第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展目的：通過OPN基因敲除小鼠誘導肝纖維化模型并給予Thr-OPN切割后暴露的有效肽段,證實Thr-OPN影響肝纖維化的進展方法：體內凝血酶原的普遍存在,使體內特異性缺失Thr-OPN的狀態(tài)不能夠實現(xiàn)。因此為了研究Thr-OPN在纖維化中的作用,我們應用OPN基因敲除小鼠,完全去除各種形式的OPN的功能,然后給予小鼠OPN-FL在凝血酶切割后暴露的有效肽段(M5 peptide),通過Masson三色染色等方法檢測CCl4誘導小鼠肝纖維化模型的纖維化程度。結果：1)在小鼠肝纖維化中,OPN缺乏能夠減輕肝纖維化程度2)凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化。結論：與肝炎患者和健康志愿者相比,Thr-OPN在肝硬化患者中表達明顯增高,并且Thr-OPN水平與促肝纖維化因子TGF-β水平呈明顯正相關。體內實驗證實Thr-OPN的表達與肝臟纖維化程度以及肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關。并且其整合素受體α4和α9的肝纖維化進展中高表達。與OPN-FL相比,Thr-OPN能夠有效活化HSCs,促進其增殖,遷移以及膠原合成的功能,并促進HSCs高水平表達Thr-OPN整合素受體α4和α9。因此我們推測Thr-OPN通過整合素受體α4和α9參與肝纖維化進展,并在促進肝纖維化進展過程中發(fā)揮重要作用。
【關鍵詞】：OPN Thr-OPN 肝纖維化 肝星狀細胞
【學位授予單位】：浙江大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 致謝6-7
• 中文摘要7-12
• Abstract12-17
• 縮略詞表17-20
• 序言20-24
• 第一部分：Thr-OPN在肝纖維化患者中的表達及其對HSCs的活化和功能影響24-58
• 1 引言24-26
• 2 研究對象,材料和方法26-45
• 2.1 研究對象26-27
• 2.2 材料和試劑27-33
• 2.3 方法33-45
• 3 結果45-56
• 3.1 肝硬化患者血漿Thr-OPN水平明顯高于慢乙肝患者和健康志愿者45-48
• 3.2 Thr-OPN的表達與血漿中肝纖維化非侵入指標的水平呈明顯正相關48-50
• 3.3 血漿中Thr-OPN的表達與TGF-β水平呈明顯的正相關50-51
• 3.4 Thr-OPN對HSCs的活化、增殖、遷移以及產(chǎn)生膠原的能力的影響51-56
• 4 討論56-58
• 第二部分：建立CCl4誘導小鼠肝纖維化模型,證實Thr-OPN參與肝纖維化的進展58-92
• 1 引言58-59
• 2 實驗材料和方法59-77
• 2.1 動物59
• 2.2 材料和試劑59-65
• 2.3 方法65-77
• 3 結果77-89
• 3.1 在小鼠肝纖維化進展過程中,Thr-OPN表達水平持續(xù)增高77-81
• 3.2 Thr-OPN的表達與肝臟中HSCs活化和膠原蛋白形成緊密相關81-84
• 3.3 Thr-OPN活化HSCs后同時能夠誘導其自身受體整合素α4和α9高表達84-89
• 4 討論89-92
• 第三部分：利用OPN基因敲除小鼠及Thr-OPN有效肽段,證實Thr-OPN參與肝纖維化的進展92-105
• 1 引言92-93
• 2 實驗材料和方法93-100
• 2.1 動物93-94
• 2.2 肽段制備94
• 2.3 材料和試劑94-97
• 2.4 方法97-100
• 3 結果100-103
• 3.1 OPN缺乏能夠減輕CCl4誘導的肝纖維化100-101
• 3.2 凝血酶切割OPN后暴露的有效肽段(M5 peptide)能夠加重OPN基因敲除小鼠肝纖維化101-103
• 4 討論103-105
• 參考文獻105-113
• 綜述113-131
• 參考文獻120-131
• 作者簡歷131-134

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