發(fā)布時間：2017-10-02 07:36

  本文關(guān)鍵詞：基于納米顆粒的乙肝表面抗原（HBsAg）核酸適體的篩選及其檢測應(yīng)用研究

  更多相關(guān)文章： 核酸適體 HBsAg 篩選 納米顆粒 化學(xué)發(fā)光 檢測

【摘要】：乙型肝炎已成為嚴(yán)重威脅人類健康的世界性疾病,也是當(dāng)前我國流行最廣泛、危害最嚴(yán)重的一種疾病。中國是世界上乙型肝炎病毒(hepatitis B virus, HBV)感染的高發(fā)區(qū),目前全國約有1億人為HBV攜帶者。乙肝表面抗原(hepatitis B surface antigen, HBsAg)是HBV感染后第一個出現(xiàn)的血清標(biāo)志物,已成為診斷HBV感染的重要指標(biāo)之一。核酸適體(aptamer)是一類新型的特異識別分子,被視為人工抗體。但與抗體相比,核酸適體穩(wěn)定性好、沒有免疫原性和毒性、能通過化學(xué)合成制備以及修飾、特異性強和親和性高。這些優(yōu)點使它有望取代和超過抗體,在生物醫(yī)學(xué)以及化學(xué)分析等領(lǐng)域起著重要的作用。SELEX (systematic evolution of ligands by exponential enrichment)技術(shù)即指數(shù)富集配體系統(tǒng)進化技術(shù),利用該技術(shù)可從人工合成的隨機單鏈寡核苷酸文庫中體外篩選出特異與靶物質(zhì)高度親和的核酸適體。化學(xué)發(fā)光法具有靈敏度高、線性范圍寬、操作簡單和易自動化等優(yōu)點,為疾病的分子檢測提供了一個良好的平臺。基于磁性納米顆粒(magnetic nanoparticles, MNPs)的磁分離具有分離速度快、效率高、操作簡單、易實現(xiàn)功能化和自動化、以及不影響分離物質(zhì)的活性等優(yōu)越的物理化學(xué)性質(zhì)和生物相容性。納米金可以作為生物分子的載體,能迅速、穩(wěn)定地與核酸和蛋白質(zhì)等生物分子結(jié)合,而幾乎不影響這些分子的生物活性。而且以納米金作探針載體,可以在納米金上負(fù)載多個信號分子,從而對目標(biāo)靶分子的檢測信號進行放大。本論文首先采用羧基化磁性納米顆粒為載體,SELEX篩選特異識別HBsAg的核酸適體,再將磁性納米顆粒、金納米顆粒、免疫分析、化學(xué)發(fā)光檢測和核酸適體技術(shù)等進行有機結(jié)合,建立了新的高靈敏、快速且經(jīng)濟實用的HBsAg檢測方法,為HBV感染的早期、快速檢測診斷奠定基礎(chǔ)。具體內(nèi)容包括：1.納米顆粒的制備、表面修飾與表征Fe304磁性納米顆粒的制備采用軟模板法制備,再采用經(jīng)典Stober法并經(jīng)改進后在Fe304顆粒表面包覆一層Si02,形成Fe3O4@SiO2磁性納米顆粒。包硅后的Fe3O4@SiO2顆粒,需進一步與蛋白質(zhì)、核酸適體和金納米顆粒等結(jié)合,因此再對其進行氨基化、羧基化和巰基化等一系列表面化學(xué)修飾。金納米顆粒采用檸檬酸鈉還原法制備,并通過自組裝技術(shù)制備金磁復(fù)合顆粒。所制備的Fe304顆粒呈圓形、大小比較均勻,粒徑為450 nm左右,分散性很好,但是表面比較粗糙；改進后的方法所制備的Fe3O4@SiO2顆粒,在Fe304的表面清晰可見包覆有一層硅,表面變光滑,而且分散性良好；Fe3O4@SiO2顆粒具有很強的磁響應(yīng)性,其磁飽和強度為43.86 emu/g;通過對Fe304顆粒、Fe3O4@SiO2顆粒、表面氨基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒、以及表面羧基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒分別進行Zeta電位測定,表明對Fe304顆粒的包硅、以及包硅后的氨基修飾和羧基修飾均很成功,為Fe3O4@SiO2顆粒作為載體進一步與蛋白質(zhì)、核酸適體等物質(zhì)結(jié)合奠定了基礎(chǔ)。所制備的金納米顆粒大小比較均勻,粒徑為15 nm左右,其Zeta電位為負(fù)值,峰值為-42.7 my；巰基修飾的Fe3O4@SiO2顆粒與金納米顆粒通過共價鍵結(jié)合、自組裝為金磁復(fù)合顆粒,在Si02表面吸附有許多金納米顆粒,但未形成明顯的核殼結(jié)構(gòu)；Fe3O4@SiO2@Au復(fù)合顆粒磁性略微有所下降,但仍然具有良好的磁響應(yīng)性,其磁飽和強度為36.42 emu/g。2.不對稱PCR擴增條件的優(yōu)化核酸適體SELEX篩選過程中,每一輪篩選均需使用單鏈寡核苷酸文庫與目標(biāo)靶分子進行孵育,本論文采用不對稱PCR擴增制備單鏈DNA文庫,PCR反應(yīng)體系為50μL。對Taq DNA聚合酶用量、上下游引物的比例、退火溫度以及擴增輪數(shù)等條件進行了優(yōu)化。優(yōu)化后的不對稱PCR擴增條件為：Taq DNA聚合酶用量1.5 U,上下游引物的比例90：1,退火溫度68℃,擴增循環(huán)數(shù)30。以不對稱擴增的ssDNA產(chǎn)物經(jīng)純化后作為下一輪篩選的文庫重復(fù)進行篩選,直至篩選結(jié)束。3.以羧基化磁性納米顆粒為載體的HBsAg核酸適體的篩選首先采用EDC、NHS兩步法活化羧基化磁性納米顆粒(Fe3O4@SiO2顆粒),然后將篩選靶分子HBsAg與活化后的羧基化磁性納米顆粒進行偶聯(lián),隨后與單鏈DNA文庫進行孵育,再經(jīng)過分離、洗脫和PCR不對稱擴增制備單鏈DNA文庫等過程篩選特異結(jié)合HBsAg的核酸適體。重復(fù)以上篩選過程,并對最后一輪篩選的產(chǎn)物進行克隆、測序以及二級結(jié)構(gòu)分析。經(jīng)過13輪篩選,隨機挑選15個克隆進行測序,結(jié)果獲得3個特異結(jié)合HBsAg的核酸適體,分別命名為H01、H02和H03,其中大部分序列為H01,表明特異結(jié)合HBsAg的高親和性核酸適體篩選成功。而且在這3個核酸適體中,H01的親和性最高,故選擇H01進行下一步的HBsAg檢測應(yīng)用。4.基于磁分離和免疫分析的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測應(yīng)用對篩選出的核酸適體H01進行氨基修飾,然后固定在羧基化MNPs表面,再捕獲待檢測樣本中的HBsAg,磁分離后再分別與抗HBsAg的鼠一抗、堿性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)標(biāo)記的馬抗鼠二抗孵育,最后磁分離獲得所述的核酸適體傳感器,用于催化AMPPD化學(xué)發(fā)光體系。用該核酸適體傳感器對純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進行檢測,結(jié)果表明：在1-200 ng/mL范圍內(nèi),化學(xué)發(fā)光強度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系；通過利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對照,該核酸適體傳感器對乙肝血清中的HBsAg具有很高的特異性；并且,該傳感器對乙肝血清中的HBsAg的檢測限可達0.1 ng/mL,低于國產(chǎn)ELISA試劑盒的檢測限0.5 ng/mL。該核酸適體傳感器與ELISA試劑盒相比較,具有快速磁分離、檢測靈敏度高等優(yōu)點,因此在HBsAg的臨床檢測中具有一定的應(yīng)用價值。5.基于雙功能化金納米顆粒的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器的構(gòu)建及檢測應(yīng)用上述構(gòu)建的基于磁分離和免疫分析的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器不足之處在于磁性納米顆粒對化學(xué)發(fā)光具有遮蔽作用,為了克服這一缺點,我們又構(gòu)建了基于雙功能化金納米顆粒的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器。用該化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器對純HBsAg蛋白和乙肝血清樣本進行檢測,結(jié)果表明：在1-225 ng/mL范圍內(nèi),化學(xué)發(fā)光強度與HBsAg濃度具有良好的線性關(guān)系；通過利用正常血清、甲肝血清、丙肝血清、以及甲、乙、丙肝混合血清作為對照,該核酸適體傳感器對乙肝血清中的HBsAg同樣具有很高的特異性；并且,該傳感器對乙肝血清中的HBsAg的檢測限可達0.05 ng/mL,低于上一章構(gòu)建的基于磁分離和免疫分析的核酸適體傳感器的檢測限0.1 ng/mL。
【關(guān)鍵詞】：核酸適體 HBsAg 篩選 納米顆粒 化學(xué)發(fā)光 檢測
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R446.6;R512.62
【目錄】：

• 中文摘要5-8
• Abstract8-15
• 縮略語15-17
• 第一章 緒論17-55
• 1.1 乙肝病毒及其檢測方法研究進展18-21
• 1.1.1 乙肝病毒簡介18-19
• 1.1.2 乙肝病毒檢測方法19-21
• 1.2 磁性納米顆粒和金納米顆粒的合成及應(yīng)用研究進展21-24
• 1.2.1 磁性納米顆粒22-23
• 1.2.2 金納米顆粒23-24
• 1.3 核酸適體的篩選與應(yīng)用研究進展24-39
• 1.3.1 SELEX的基本原理和過程25-26
• 1.3.2 提高核酸適體選擇性的SELEX改進方法26-28
• 1.3.3 高效SELEX篩選方法28-32
• 1.3.4 細胞SELEX32-34
• 1.3.5 核酸適體在生物醫(yī)學(xué)中的應(yīng)用34-39
• 1.4 化學(xué)發(fā)光39-41
• 1.5 研究目的和意義41-42
• 參考文獻42-55
• 第二章 納米顆粒的制備、表面修飾與表征55-73
• 2.1 引言55-56
• 2.1.1 Fe_3O_4磁性納米顆粒表面改性及修飾55-56
• 2.1.2 金磁復(fù)合顆粒56
• 2.2 實驗材料與方法56-60
• 2.2.1 實驗試劑與儀器57-58
• 2.2.2 實驗方法58-60
• 2.3 實驗結(jié)果與討論60-67
• 2.3.1 Fe_3O_4顆粒包SiO_2前后形貌及分散性60-61
• 2.3.2 Fe_3O_4顆粒包SiO_2前后粒徑分布61-62
• 2.3.3 金納米顆粒形貌和Zeta電位62-63
• 2.3.4 自組裝型金磁復(fù)合顆粒形貌63-64
• 2.3.5 Fe_3O_4@SiO_2顆粒和金磁復(fù)合顆粒磁響應(yīng)性64
• 2.3.6 Fe_3O_4顆粒表面各種修飾后Zeta電位變化64-66
• 2.3.7 納米顆粒表面EDS元素分析66-67
• 2.4 本章小結(jié)67-68
• 參考文獻68-73
• 第三章 以羧基化MNPs為介質(zhì)的HBsAg核酸適體的篩選73-91
• 3.1 引言73-74
• 3.1.1 篩選靶分子HBsAg73
• 3.1.2 以羧基化MNPs為介質(zhì)的SELEX篩選73-74
• 3.2 實驗材料與方法74-81
• 3.2.1 實驗試劑與儀器74-76
• 3.2.2 實驗方法76-81
• 3.3 實驗結(jié)果與討論81-87
• 3.3.1 以微孔板為介質(zhì)的SELEX篩選法摸索81
• 3.3.2 不對稱PCR擴增條件優(yōu)化81-83
• 3.3.3 每輪不對稱PCR擴增產(chǎn)物電泳圖83
• 3.3.4 親和力測定83-84
• 3.3.5 核酸適體克隆、測序84-86
• 3.3.6 二級結(jié)構(gòu)分析86
• 3.3.7 三個不同核酸適體的親和性比較86-87
• 3.4 本章小結(jié)87
• 參考文獻87-91
• 第四章 基于磁分離和免疫分析的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器檢測HBsAg研究91-105
• 4.1 引言91-92
• 4.2 實驗材料與方法92-96
• 4.2.1 實驗試劑與儀器92-94
• 4.2.2 實驗方法94-96
• 4.3 實驗結(jié)果與討論96-101
• 4.3.1 檢測條件的優(yōu)化96-99
• 4.3.2 對純HBsAg蛋白的檢測99
• 4.3.3 對乙肝血清樣本中HBsAg的檢測99-100
• 4.3.4 特異性實驗100
• 4.3.5 檢測系統(tǒng)可行性實驗100-101
• 4.4 本章小結(jié)101
• 參考文獻101-105
• 第五章 基于雙功能化金納米顆粒的化學(xué)發(fā)光核酸適體傳感器檢測HBsAg研究105-117
• 5.1 引言105-106
• 5.2 實驗材料與方法106-109
• 5.2.1 實驗試劑與儀器106-107
• 5.2.2 實驗方法107-109
• 5.3 實驗結(jié)果與討論109-115
• 5.3.1 檢測條件的優(yōu)化109-112
• 5.3.2 對純HBsAg蛋白的檢測112-113
• 5.3.3 對乙肝血清樣本中HBsAg的檢測113
• 5.3.4 特異性實驗113-114
• 5.3.5 檢測系統(tǒng)可行性實驗114-115
• 5.4 本章小結(jié)115
• 參考文獻115-117
• 第六章 總結(jié)與展望117-119
• 附錄119-121
• 致謝121

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