本文關(guān)鍵詞：體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞活化、增殖的影響

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【摘要】：肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)的活化和增殖是肝纖維化發(fā)生的中心環(huán)節(jié),活化的HSCs是合成細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的主要細(xì)胞,HSCs的活化與增殖可大量合成ECM,在肝組織內(nèi)異常沉積,從而引起肝纖維化。巨噬細(xì)胞作為機(jī)體重要的固有免疫細(xì)胞,在HSCs活化、增殖中起到調(diào)控作用。在肝纖維化進(jìn)展過程中,寄居在肝臟中的巨噬細(xì)胞(macrophages,M?)即枯否細(xì)胞(Kuffer cells,KCs)通過分泌腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor,TNF-α)、白介素-1β(interleukin,IL-1β)和血小板衍生生長因子-BB(platelet-derived growth factor,PDGF-BB)等促炎、促纖維化因子造成肝細(xì)胞損傷,促進(jìn)HSCs的活化與增殖;而被激活的HSCs和損傷的肝細(xì)胞分泌CC族趨化因子2(CC chemokine ligan 2,CCL2)為主的趨化因子進(jìn)一步募集血液中的單核巨噬細(xì)胞加重肝損傷和促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。因此,研究巨噬細(xì)胞的功能及其對HSCs的影響對進(jìn)一步了解肝纖維化發(fā)生機(jī)制非常重要。腫瘤壞死因子樣配體1A(tumor necrosis factor-like ligand 1 aberrance,TL1A)是腫瘤壞死因子超家族成員15(tumor necrosis factor superfamily member 15,TNFSF15)基因的蛋白產(chǎn)物,主要在內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、漿細(xì)胞、單個(gè)核細(xì)胞和樹突細(xì)胞表達(dá)。我們課題組前期研究證明,TL1A可促進(jìn)慢性實(shí)驗(yàn)性結(jié)腸炎小鼠腸纖維化的發(fā)生以及促進(jìn)腸組織中巨噬細(xì)胞的活化與募集。目前為止對于TL1A在肝臟疾病中的研究比較少見,在原發(fā)性膽汁性肝硬化患者血清和肝組織巨噬細(xì)胞中TL1A表達(dá)升高,且在熊去氧膽酸治療后血清TL1A水平下降。由此可見TL1A的高表達(dá)有可能促進(jìn)肝纖維化發(fā)生。TL1A作為TNF的唯一配體,可通過與其受體死亡受體3(death receptor 3,DR3)結(jié)合,誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞的活化。既往有大量體外研究證實(shí)巨噬細(xì)胞可促進(jìn)HSCs的活化、增殖,但尚無研究TL1A高表達(dá)的巨噬細(xì)胞對HSCs活化增殖的影響。為此,本實(shí)驗(yàn)在于探索體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對HSCs活化、增殖的影響,有可能為肝纖維化的治療提供新靶點(diǎn)。目的:探討體外高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞對肝星狀細(xì)胞的活化、增殖的影響。方法:(1)采用real-time Q-PCR方法進(jìn)行FMS-TL1A-GFP transgenic基因型小鼠的鑒定與篩選;(2)分離、分化并活化C57BL/6野生型(wild type,WT)與轉(zhuǎn)基因(transgenic,Tg)小鼠骨髓來源的巨噬細(xì)胞(bone marrow-derived macrophages,BMMs)和腹腔巨噬細(xì)胞(peritoneal macrophages,PMs);采用原位循環(huán)灌流和密度梯度離心技術(shù)分離WT小鼠原代HSCs;(3)實(shí)驗(yàn)分組:M?部分:BMMs與PMs分別分為Control/WT組、LPS+IFN-γ/WT組、Control/Tg組、LPS+IFN-γ/Tg組;HSCs部分:收取LPS+IFN-γ/WT組及LPS+IFN-γ/Tg組培養(yǎng)液上清,為條件培養(yǎng)基(conditional medium,CM);將CM分別干預(yù)小鼠原代HSCs,實(shí)驗(yàn)分組如下:Control組,以含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs;LPS+IFN-γ+M-CSF組,以含10%胎牛血清的DMEM細(xì)胞培養(yǎng)液培養(yǎng)小鼠原代HSCs,并加入LPS、IFN-γ和M-CSF(PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs不加M-CSF);CM WT組,用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/WT組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代HSCs;CM Tg組,用含10%胎牛血清的LPS+IFN-γ/Tg組條件培養(yǎng)基培養(yǎng)小鼠原代HSCs;(4)熒光顯微鏡觀察剛分離的原代HSCs;免疫熒光法檢測M?F4/80與TL1A共表達(dá)情況以及HSCs標(biāo)志物結(jié)蛋白(desmin)與α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-smooth muscle actin,α-SMA)的表達(dá)情況;CCK-8法檢測M?CM促HSCs增殖的最適濃度以及CCK-8法及Brd U法檢測HSCs增殖情況;real-time Q-PCR方法檢測M?TL1A與DR3以及HSCs 2、4、6天的α-SMA m RNA表達(dá)情況;Western blot方法檢測M?TL1A與DR3蛋白表達(dá)情況;酶聯(lián)吸附反應(yīng)試驗(yàn)(enzyme-linked immune sorbent assay,ELISA)測定各組M?培養(yǎng)上清液中IL-1β和PDGF-BB的含量。結(jié)果:(1)根據(jù)基因FMS-TL1A-GFP序列測定小鼠DNA,Tg小鼠目的基因測定成像在191 bp位置,而WT小鼠基因測定成像,在191 bp位置未檢測到目的基因,據(jù)此篩選鑒定Tg小鼠。(2)成功分離出BMMs及PMs,每只小鼠細(xì)胞得率分別為90×106~110×106、10×106~12×106,細(xì)胞存活率大于95%。(3)免疫熒光細(xì)胞化學(xué)結(jié)果顯示M?胞膜有F4/80表達(dá),且Tg組TL1A蛋白表達(dá)水平較WT組明顯升高(BMMs:0.029±0.002 vs0.011±0.002,P0.01;PMs:0.025±0.002 vs 0.010±0.002,P0.01);對于BMMs,real-time Q-PCR方法檢測TL1A m RNA在各組表達(dá)結(jié)果顯示:巨噬細(xì)胞加入LPS、IFN-γ刺激后TL1A m RNA表達(dá)量較相應(yīng)對照組明顯升高,P0.01,且與LPS+IFN-γ/WT組相比,LPS+IFN-γ/Tg組升高更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,P0.01;Western blot方法檢測TL1A蛋白在各組表達(dá)結(jié)果顯示:LPS+IFN-γ/WT組較Control/WT組TL1A蛋白表達(dá)無明顯差異,P0.05,Tg小鼠巨噬細(xì)胞TL1A蛋白表達(dá)量明顯高于WT小鼠巨噬細(xì)胞,P0.01,且與Control/Tg組相比,LPS+IFN-γ/Tg組升高更為顯著,P0.01;對于PMs的檢測結(jié)果與上述趨勢一致,證明成功提取出TL1A高表達(dá)的M?。(4)BMMs和PMs的DR3 m RNA和蛋白表達(dá)水平各組之間無明顯差異,P0.05。(5)采用肝臟原位灌注法,以Percoll為介質(zhì)密度梯度離心,分離小鼠原代HSCs。細(xì)胞得率為0.8×106~1.0×106/只,存活率和純度均大于90%。在倒置顯微鏡下觀察剛分離出的HSCs呈圓形,胞漿中含有較多脂滴,在波長328 nm的熒光顯微鏡下觀察,HSCs自發(fā)藍(lán)色熒光;24 h HSCs貼壁后進(jìn)行免疫熒光法可檢測到desmin。(6)CCK-8法結(jié)果顯示應(yīng)用60%BMMs和PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs 24 h對其促進(jìn)增殖效果最為顯著。(7)CCK-8法檢測HSCs增殖速率結(jié)果顯示:應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,LPS+IFN-γ+M-CSF組(100.54%±8.11%)與Control組(100.82%±8.48%)無明顯差異(P0.05),而與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比,應(yīng)用CM培養(yǎng)的HSCs增殖速率顯著升高,且CM Tg組(246.21%±8.34%)明顯高于CM WT組(203.24%±10.50%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);應(yīng)用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,檢測結(jié)果與上述趨勢一致。(8)Brd U法檢測HSCs DNA合成速率結(jié)果顯示:應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,LPS+IFN-γ+M-CSF組(102.01%±8.04%)與Control組(100.00%±8.62%)無明顯差異(P0.05),而與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比,應(yīng)用CM培養(yǎng)的HSCs DNA合成速率顯著升高,且CM Tg組(182.24%±8.68%)明顯高于CM WT組(150.75%±9.12%),差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);應(yīng)用PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,檢測結(jié)果與上述趨勢一致。(9)應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,免疫熒光法分別檢測2、4、6天α-SMA蛋白表達(dá)量,結(jié)果顯示:第2天和第6天時(shí)各組間無明顯差異,P0.05;第4天時(shí)Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P0.05),與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比,應(yīng)用CM干預(yù)的HSCsα-SMA表達(dá)水平顯著升高,且CM/Tg組明顯高于CM/WT組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs的檢測結(jié)果與上述趨勢一致。(10)應(yīng)用BMMs來源的CM培養(yǎng)HSCs,real-time Q-PCR法分別檢測2、4、6天α-SMA m RNA表達(dá)含量,結(jié)果顯示:第2天時(shí)各組無明顯差異,P0.05;第4天時(shí)Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P0.05),與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比,CM組α-SMA表達(dá)水平顯著升高(P0.01),且CM/Tg組明顯高于CM/WT組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);第6天時(shí)Control組與LPS+IFN-γ+M-CSF組無明顯差異(P0.05),與Control組及LPS+IFN-γ+M-CSF組相比,CM組α-SMA表達(dá)水平顯著升高,且CM/Tg組明顯高于CM/WT組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);PMs來源的CM培養(yǎng)HSCs的檢測結(jié)果與上述趨勢一致。(11)ELISA檢測結(jié)果顯示:對于BMMs的培養(yǎng)上清液,加入LPS和IFN-γ刺激后的巨噬細(xì)胞與相應(yīng)對照組相比,IL-1β和PDGF-BB表達(dá)水平顯著升高(P0.01),且LPS+IFN-γ/Tg組比LPS+IFN-γ/WT組升高更明顯,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);而對于PMs的培養(yǎng)上清液,除LPS+IFN-γ/Tg組比LPS+IFN-γ/WT組的PDGF-BB升高明顯(P0.05)外,余檢測結(jié)果與上述趨勢一致。結(jié)論:高表達(dá)TL1A的巨噬細(xì)胞可能通過IL-1β和PDGF-BB分泌增加促進(jìn)HSCs的活化與增殖。
【關(guān)鍵詞】：肝纖維化 巨噬細(xì)胞 肝星狀細(xì)胞 腫瘤壞死因子樣配體1A 死亡受體3 白介素-1β 血小板衍生生長因子-BB
【學(xué)位授予單位】：河北醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-8
• 英文摘要8-13
• 英文縮寫13-14
• 前言14-16
• 材料與方法16-30
• 結(jié)果30-37
• 附圖37-49
• 附表49-51
• 討論51-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-58
• 綜述 肝星狀細(xì)胞活化、增殖的免疫機(jī)制研究58-68
• 參考文獻(xiàn)63-68
• 致謝68-69
• 個(gè)人簡歷69

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前2條

1 Zhi-Zhi Xing;Liu-Ye Huang;Cheng-Rong Wu;Hong You;Hong Ma;Ji-Dong Jia;;Activated rat hepatic stellate cells influence Th1/Th2 profile in vitro[J];World Journal of Gastroenterology;2015年23期

2 Dong-Hong Lu;Xiao-Yun Guo;Shan-Yu Qin;Wei Luo;Xiao-Li Huang;Mei Chen;Jia-Xu Wang;Shi-Jia Ma;Xian-Wen Yang;Hai-Xing Jiang;;Interleukin-22 ameliorates liver fibrogenesis by attenuating hepatic stellate cell activation and downregulating the levels of inflammatory cytokines[J];World Journal of Gastroenterology;2015年05期

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本文編號(hào)：955802