本文關(guān)鍵詞：ω-3 PUFA調(diào)節(jié)膜脂組成緩解NAFLD中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激作用機(jī)制研究

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【摘要】：非酒精性脂肪性肝病(non-alcoholic fatty liver diseases,NAFLD)是臨床上最為常見的的慢性肝病之一,其致病機(jī)制錯綜復(fù)雜,目前尚無有效的治療藥物。研究表明,ω-3 PUFA是食物油脂中的重要脂肪酸類營養(yǎng)素,在降低血脂、改善心血管功能、降低系統(tǒng)性炎癥及增加胰島素敏感性等方面發(fā)揮著積極作用。近來研究顯示:ω-3 PUFA對NAFLD也有緩解作用,但其具體的作用機(jī)制尚不清楚。本研究通過建立高脂高膽固醇飼喂誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型,及高飽和脂肪酸(PA)負(fù)荷誘導(dǎo)的BRL肝細(xì)胞模型,從動物實(shí)驗及細(xì)胞實(shí)驗研究ω-3 PUFA對NAFLD的改善作用及其機(jī)制,為ω-3PUFA的營養(yǎng)作用及其對NAFLD的營養(yǎng)干預(yù)提供新的思路。第一部分:魚油、紫蘇油對大鼠NAFLD的改善作用目的:高脂高膽固醇飼喂Sprague-Dawley(SD)雄性大鼠,建立NAFLD的動物模型,觀察魚油及紫蘇油對非酒精性脂肪肝的改善作用。方法:SD雄性大鼠192只,每組48只,隨機(jī)分成4組:正常對照組(CON),高脂高膽固醇組(HFD),魚油干預(yù)組(FOH),紫蘇油干預(yù)組(POH)。分別于飼喂的4周、8周、12周、16周斷頭取血,稱取體重、肝重,檢測大鼠血生化指標(biāo),包括:血清肝酶(ALT、AST)、血脂(TCH、TGH、LDL-C、HDL-C、FFA),以及相關(guān)的SOD、GST活性變化。肝組織學(xué)檢測:制作肝組織石蠟切片,進(jìn)行蘇木素-伊紅(HE)染色以及Masson染色分析。分子檢測:RT-PCR檢測內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志基因BIP、ATP6的表達(dá)。結(jié)果:飼喂到8周時,HFD組較CON組肝指數(shù)明顯升高,血清ALT、TCH、FFA水平均顯著性升高,HDL-C顯著性降低,肝細(xì)胞氣球樣變明顯,呈現(xiàn)出大小泡混合型肝細(xì)胞脂肪變性,小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤、纖維化明顯,呈現(xiàn)典型的炎性病變;FOH組和POH組較HFD組肝指數(shù)顯著降低,血清脂質(zhì)指標(biāo)及肝酶活性都顯著性降低,肝細(xì)胞氣球樣變、脂肪變性、小葉內(nèi)和匯管區(qū)炎性細(xì)胞浸潤、纖維化均有不同程度的改善。飼喂到16周時,觀察到HFD組大鼠肝細(xì)胞脂質(zhì)聚積脂肪變性,并且肝組織炎性浸潤和纖維化嚴(yán)重,而魚油及紫蘇油干預(yù)組改善效果明顯。第16周的RT-PCR檢測結(jié)果顯示,HFD組肝組織BIP、ATP6表達(dá)都顯著高于正常組大鼠,而魚油及紫蘇油能顯著降低這些基因的表達(dá)。結(jié)論:高脂高膽固醇飲食誘導(dǎo)的NAFLD大鼠模型建立成功,魚油、紫蘇油干預(yù)能起到明顯的降低血脂、改善肝功能、緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和NAFLD的進(jìn)展。第二部分:ω-3PUFA緩解高飽和脂肪酸負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠BRL肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制研究目的:建立PA過載誘導(dǎo)的BRL肝細(xì)胞損傷模型,探究ω-3 PUFA緩解BRL肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制。方法:MTT實(shí)驗檢測不同濃度的PA孵育對BRL細(xì)胞增殖活性的影響,確定孵育濃度。設(shè)置6個細(xì)胞實(shí)驗組:正常組、PA負(fù)荷組、PA+DHA干預(yù)組、PA+EPA干預(yù)組、PA+ALA干預(yù)組、PA+AA干預(yù)組。采用Real-time PCR檢測ATF6、BIP、SERCA、PEMT mRNA的表達(dá),HPLC/MS檢測細(xì)胞膜磷脂酰膽堿(PC)、磷脂酰乙醇胺(PE)的組成,GC/MS檢測細(xì)胞膜脂肪酸組成,Fura-2AM熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度,流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。結(jié)果:PA最適孵育濃度為75μM,當(dāng)PA濃度超過75μM時細(xì)胞增殖活性明顯減弱,細(xì)胞開始出現(xiàn)大面積凋亡及死亡。PA負(fù)荷組相較于正常組內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標(biāo)志分子ATF6、BIP的mRNA和蛋白均表達(dá)上調(diào),出現(xiàn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上的鈣泵蛋白SERCA mRNA表達(dá)下調(diào);磷脂酰乙醇胺N甲基轉(zhuǎn)移酶基因(PEMT)表達(dá)上調(diào);同時膜磷脂檢測結(jié)果顯示:細(xì)胞膜PC/PE比值升高;胞漿內(nèi)游離Ca2+濃度顯著上調(diào)。各種ω-3 PUFA干預(yù)結(jié)果顯示:相較于PA負(fù)荷組,ω-3 PUFA干預(yù)組SERCA mRNA表達(dá)上調(diào),其他各檢測指標(biāo)都相應(yīng)下調(diào)。PA+AA干預(yù)組相較于正常組ATF6、BIP、PEMT mRNA表達(dá)上調(diào),SERCA mRNA表達(dá)下調(diào),細(xì)胞膜PC/PE比值上調(diào),細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度顯著上調(diào);相較于PA干預(yù)組,無顯著性差異。結(jié)論:PA負(fù)荷會通過上調(diào)PEMT的表達(dá)引起細(xì)胞膜PE向PC轉(zhuǎn)化,導(dǎo)致PC/PE升高,影響內(nèi)質(zhì)網(wǎng)鈣泵SERCA活性降低,不能將胞漿內(nèi)Ca2+泵入內(nèi)質(zhì)網(wǎng),導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度升高,Ca2+穩(wěn)態(tài)失衡,引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致了肝細(xì)胞損傷。當(dāng)用ω-3 PUFA干預(yù)時,下調(diào)了PEMT基因的表達(dá),抑制了PE向PC轉(zhuǎn)化,PC/PE降低,上調(diào)了SERCA基因的表達(dá)和活性,加速了游離Ca2+泵回到內(nèi)質(zhì)網(wǎng)儲存,緩解了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激,對肝細(xì)胞損傷起到了明顯的改善作用,而AA(屬于ω-6 PUFA)的干預(yù)沒有這樣的作用。
【關(guān)鍵詞】：ω-3PUFA 非酒精性脂肪肝 高脂飲食 肝細(xì)胞 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激 鈣離子
【學(xué)位授予單位】：武漢輕工大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要4-6
• ABSTRACT6-11
• 主要縮寫詞11-12
• 1 緒論12-18
• 1.1 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與非酒精性脂肪肝研究進(jìn)展12-15
• 1.1.1 非酒精性脂肪肝病的概述12
• 1.1.2 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及其激活途徑12-14
• 1.1.3 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與NAFLD14-15
• 1.2 Ω-3 多不飽和脂肪酸15-17
• 1.2.1 ω-3PUFA與心腦血管疾病16
• 1.2.2 ω-3PUFA與炎癥16
• 1.2.3 ω-3PUFA與癌癥16
• 1.2.4 ω-3PUFA與NAFLD16-17
• 1.3 立題依據(jù)與研究內(nèi)容17-18
• 2 NAFLD動物模型的建立18-33
• 2.1 實(shí)驗材料與方法18-24
• 2.1.1 主要試劑18-19
• 2.1.2 主要儀器19-20
• 2.1.3 動物和飼料20-21
• 2.1.4 血液樣本、肝臟組織采集21-22
• 2.1.5 血液生化指標(biāo)檢測22
• 2.1.6 組織病理學(xué)分析22
• 2.1.7 肝組織總RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄成cDNA22-23
• 2.1.8 引物設(shè)計23
• 2.1.9 Real-time PCR23
• 2.1.10 數(shù)據(jù)統(tǒng)計23-24
• 2.2 實(shí)驗結(jié)果24-32
• 2.2.1 高脂高膽固醇飲食對大鼠體重及肝重的影響24-25
• 2.2.2 各組大鼠血清脂質(zhì)水平25-27
• 2.2.3 各組大鼠血清FFA、GST、SOD水平27-28
• 2.2.4 各組大鼠血清ALT、AST水平28-29
• 2.2.5 大鼠肝組織病理H&E、Masson染色結(jié)果29-32
• 2.2.6 大鼠肝組織BIP、ATF4 mRNA表達(dá)結(jié)果32
• 2.3 結(jié)論32-33
• 3 Ω-3PUFA緩解PA負(fù)荷誘導(dǎo)的大鼠BRL肝細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用機(jī)制研究33-49
• 3.1 材料與方法33-38
• 3.1.1 主要試劑33
• 3.1.2 主要儀器33-34
• 3.1.3 PA對BRL細(xì)胞增殖活性實(shí)驗34-35
• 3.1.4 細(xì)胞分組35
• 3.1.5 細(xì)胞RNA提取及逆轉(zhuǎn)錄成cDNA35
• 3.1.6 引物設(shè)計35-36
• 3.1.7 Real-time PCR36
• 3.1.8 細(xì)胞膜PC、PE超高效液相質(zhì)譜檢測36-37
• 3.1.9 細(xì)胞膜脂肪酸組成GC/MS檢測37
• 3.1.10 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度檢測37-38
• 3.1.11 流式細(xì)胞儀Annexin V/PI雙染色法檢測細(xì)胞凋亡38
• 3.1.12 統(tǒng)計學(xué)分析38
• 3.2 實(shí)驗結(jié)果38-47
• 3.2.1 不同濃度PA對BRL細(xì)胞增殖活性MTT檢測38-39
• 3.2.2 目的基因BIP、ATF6 mRNA水平的表達(dá)39-40
• 3.2.3 目的基因PEMT、SERCA在mRNA水平表達(dá)情況40
• 3.2.4 液相質(zhì)譜聯(lián)用檢測細(xì)胞膜PC、PE相對含量40-41
• 3.2.5 氣相質(zhì)譜聯(lián)用檢測細(xì)胞膜磷脂脂肪酸組成41-44
• 3.2.6 細(xì)胞內(nèi)游離Ca2+濃度檢測結(jié)果44-45
• 3.2.7 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡45-47
• 3.3 結(jié)論47-49
• 4 討論49-51
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 致謝56-57
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果57

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6 徐彬;李紹鈺;魏鳳仙;焦玉萍;孫全友;王琳q，

本文編號：948172