本文關(guān)鍵詞：戊型肝炎規(guī)范化實(shí)驗(yàn)室診斷模式的建立

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【摘要】：目的:1.系統(tǒng)評(píng)估我國主流HEV抗原/抗體ELISA檢測(cè)試劑盒的診斷靈敏度、特異度及相互間結(jié)果符合度,形成可指導(dǎo)臨床實(shí)驗(yàn)室應(yīng)用的HEV血清學(xué)檢測(cè)試劑盒的質(zhì)量報(bào)告,以規(guī)范戊型肝炎的實(shí)驗(yàn)室診斷流程。2.設(shè)計(jì)出充分滿足臨床診斷靈敏度和特異度要求的能夠檢測(cè)HEV不同基因型病毒株的一步法熒光定量逆轉(zhuǎn)錄PCR(Real-time RT-PCR)檢測(cè)體系;并初步建立起HEV RNA考評(píng)血清盤和質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,用于評(píng)價(jià)HEV核酸檢測(cè)的質(zhì)量評(píng)估。3.建立起不依賴特殊設(shè)備和專業(yè)人員操作的快捷高效檢測(cè)HEV RNA的逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP)平臺(tái)。方法:1.收集戊肝患者、健康體檢人群、風(fēng)濕免疫病患者及巨細(xì)胞病毒(CMV)和EB病毒感染早期患者血清樣本,分別用萬泰、科華、貝爾、麗珠、新創(chuàng)HEV IgM和IgG抗體檢測(cè)試劑盒對(duì)上述標(biāo)本進(jìn)行平行檢測(cè),以考察不同試劑盒各自的診斷靈敏度和特異度及相互間的結(jié)果符合率。2.用HEV細(xì)胞培養(yǎng)上清液作為中和抗原,通過中和抑制實(shí)驗(yàn)的方法來驗(yàn)證各HEV抗體檢測(cè)試劑盒間檢測(cè)結(jié)果不一致時(shí)是否為真陽性。3.在HEV ORF3高度保守區(qū)設(shè)計(jì)能檢測(cè)HEV不同基因型病毒株的PCR引物和探針引物,建立起一步法(Real time RT-PCR)檢測(cè)體系;將擬擴(kuò)增的HEV RNA目的基因片段構(gòu)建成質(zhì)粒,以建立HEV質(zhì)粒DNA標(biāo)準(zhǔn)品,用于濃度標(biāo)準(zhǔn)曲線的構(gòu)建;構(gòu)建HEV基因1-4型病毒株細(xì)胞培養(yǎng)體系,將培養(yǎng)上清液通過陰性血清倍比稀釋的方式初步建立評(píng)價(jià)HEV RNA檢測(cè)的考評(píng)血清盤。4.在HEV基因組保守區(qū)域內(nèi)的6個(gè)位點(diǎn)區(qū)域設(shè)計(jì)4條特異性引物,建立起適用于不同基因型HEV RNA檢測(cè)的一步法逆轉(zhuǎn)錄環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(RT-LAMP);采集臨床患者血清標(biāo)本和豬、兔糞便標(biāo)本分別用RT-LAMP方法、Real time RT-PCR及逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR(RT-nPCR)方法進(jìn)行并行檢測(cè),以驗(yàn)證RT-LAMP方法的有效性;用其它病毒性肝炎病原體來驗(yàn)證其特異性,通過陽性標(biāo)本HEV RNA梯度倍比稀釋的方式來驗(yàn)證其靈敏度。結(jié)果:1.不同廠家HEV IgM抗體檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果具有良好的一致性,診斷靈敏度普遍欠佳,均未超過85%,特異度很好,未在非戊肝患者人群中發(fā)現(xiàn)HEV IgM抗體陽性現(xiàn)象。2.不同廠家HEV IgG抗體檢測(cè)試劑盒在戊肝患者人群中檢測(cè)結(jié)果具有較好的一致性,診斷靈敏度較高(90%以上),在非戊肝患者人群中,檢測(cè)結(jié)果有較大差異,以萬泰和科華為例,萬泰試劑盒在非戊肝患者人群中抗體陽性率在16.5%-31.9%之間,而科華陽性率僅為1.1%-3.3%之間。3.通過中和抑制試驗(yàn)未發(fā)現(xiàn)萬泰檢測(cè)試劑盒有假陽性現(xiàn)象,進(jìn)一步說明了萬泰igg抗體試劑盒檢測(cè)靈敏度較高,而其它幾種試劑盒容易出現(xiàn)假陰性現(xiàn)象。4.hev抗原檢測(cè)試劑盒與igm和igg抗體檢測(cè)結(jié)果及hevrna檢測(cè)有很高的相關(guān)性,未發(fā)現(xiàn)igm和igg抗體均陰性而hev抗原陽性的病例。5.本研究建立了能夠高效擴(kuò)增包含兔hev病毒株在內(nèi)的基因1-4型hev病毒株的檢測(cè),適用于血清和糞便等標(biāo)本,最低檢測(cè)限可達(dá)25copies/test,較傳統(tǒng)rt-npcr靈敏度高10倍以上;在103和106copies/μl兩個(gè)濃度水平處,該方法批內(nèi)和批間精密度分別低于2%和3%,具有很好的重復(fù)性;經(jīng)臨床標(biāo)本驗(yàn)證分析發(fā)現(xiàn)能夠用于戊肝患者及動(dòng)物宿主的血清和糞便標(biāo)本檢測(cè),且靈敏度顯著高于rt-npcr。6.本研究構(gòu)建了hev質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品及hevrna考評(píng)血清盤,經(jīng)穩(wěn)定性驗(yàn)證評(píng)估,能夠初步滿足臨床應(yīng)用需求。7.本研究成功構(gòu)建了適用于包含兔hev在內(nèi)基因1-4型hevrnart-lamp檢測(cè)方法。該方法最低檢測(cè)限度為5copies/test,顯著優(yōu)于rt-npcr技術(shù),略優(yōu)于realtimert-pcr技術(shù)。與hav,hbv和hcv患者血清標(biāo)本對(duì)無交叉反應(yīng),特異度良好。233份血清或糞便標(biāo)本對(duì)該技術(shù)進(jìn)行檢測(cè)效能驗(yàn)證,并將該方法與realtimert-pcr和rt-npcr分別進(jìn)行平行檢測(cè)。結(jié)果顯示rt-lamp和realtimert-pcr檢測(cè)陽性率顯著高于rt-npcr,而兩者間檢測(cè)符合率高達(dá)92%,未發(fā)現(xiàn)realtimert-pcr或rt-npcr檢測(cè)陽性而rt-lamp檢測(cè)陰性的標(biāo)本。結(jié)論:1.不同廠家hevigm抗體檢測(cè)試劑盒之間的檢測(cè)結(jié)果差異較小,對(duì)戊肝臨床診斷的靈敏度均在80%以上,特異性較高。hevigg抗體檢測(cè)試劑盒較igm檢測(cè)試劑盒更靈敏,但診斷特異度在不同廠家之間差異較大,經(jīng)綜合比較發(fā)現(xiàn)科華igg抗體檢測(cè)試劑盒較適合于戊肝臨床診斷檢測(cè),與igm抗體檢測(cè)試劑盒配伍使用,能很好地彌補(bǔ)其靈敏度不足,又能有效解決自身診斷特異度不足的問題。2.萬泰igg抗體試劑盒較其它3種廠家靈敏度最高,更加適合于流行病學(xué)調(diào)查,鑒于科華試劑盒較低的檢測(cè)靈敏度,不適合應(yīng)用于流行病學(xué)調(diào)查。3.hev抗原檢測(cè)試劑盒與hevrna檢測(cè)有很好的相關(guān)性,雖然其出現(xiàn)最早,能有效縮短hev感染的檢測(cè)窗口期,但鑒于戊肝的發(fā)病特點(diǎn),當(dāng)患者有癥狀就醫(yī)時(shí)抗體往往已經(jīng)出現(xiàn),因此hev抗原檢測(cè)在臨床應(yīng)用中的價(jià)值仍需進(jìn)一步研究,本研究未發(fā)現(xiàn)其能提高h(yuǎn)ev感染診斷效率的證據(jù)。4.本研究建立了能夠高效擴(kuò)增包含兔hev病毒株在內(nèi)的基因1-4型hev病毒株的hevrna一步法realtimert-pcr檢測(cè)體系,適用于血清和糞便等標(biāo)本的檢測(cè),具有檢測(cè)靈敏度、特異性高,重復(fù)性好等特點(diǎn),值得進(jìn)一步優(yōu)化后進(jìn)行商品化嘗試。5.本研究構(gòu)建了Real time RT-PCR所需的質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品,該標(biāo)準(zhǔn)品易制備、易精確定量,儲(chǔ)存條件簡(jiǎn)單,穩(wěn)定性好。解決了HEV RNA Real time RT-PCR檢測(cè)臨床實(shí)驗(yàn)室推廣應(yīng)用的瓶頸。6.本研究初步制備了HEV RNA檢測(cè)考評(píng)血清盤,對(duì)Real-time RT-PCR檢測(cè)HEV RNA的臨床推廣所面臨的標(biāo)準(zhǔn)化和結(jié)果可控可比的問題進(jìn)行了初步探索。該血清盤目前針對(duì)我國HEV感染人群和動(dòng)物宿主中主要基因型(基因4型)的特點(diǎn)而制備,未來仍需進(jìn)一步完善豐富其覆蓋的基因型別。7.本研究初步建立了RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HEV RNA的新方法,在特異度、靈敏度和臨床標(biāo)本檢測(cè)驗(yàn)證中表現(xiàn)出了良好效果。該方法不需要昂貴的設(shè)備和繁瑣的電泳分析過程,能高效快速的檢測(cè)出我國HEV各型主要基因型病毒株,有望成為醫(yī)院臨床實(shí)驗(yàn)室特別是HEV流行區(qū)基層醫(yī)療單位HEV核酸篩查檢測(cè)的新方法。
【關(guān)鍵詞】：戊型病毒性肝炎 環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)(LAMP) 中和抑制試驗(yàn) 考評(píng)血清盤 逆轉(zhuǎn)錄熒光定量PCR 逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.6;R446.6
【目錄】：

• 中文摘要4-7
• Abstract7-11
• 縮略語/符號(hào)說明11-12
• 前言12-20
• 研究現(xiàn)狀、成果12-16
• 研究目的、方法16-20
• 一、戊肝血清學(xué)診斷試劑盒的效能評(píng)價(jià)20-34
• 1.1 對(duì)象和方法20-28
• 1.1.1 標(biāo)本來源及試劑耗材和設(shè)備情況20-21
• 1.1.2 不同品牌HEV抗原/抗體ELISA試劑盒檢測(cè)效能評(píng)估21-27
• 1.1.3 中和抑制試驗(yàn)考評(píng)試劑盒檢測(cè)特異性27-28
• 1.1.4 統(tǒng)計(jì)處理28
• 1.2 結(jié)果28-31
• 1.2.1 不同品牌試劑盒檢測(cè)結(jié)果分析28-30
• 1.2.2 中和抑制試驗(yàn)結(jié)果分析30-31
• 1.2.3 HEV抗原檢測(cè)結(jié)果與IgM/Ig G及核酸檢測(cè)結(jié)果的相關(guān)性分析31
• 1.3 討論31-33
• 1.4 小結(jié)33-34
• 二、規(guī)范化HEV RNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)及考評(píng)體系的建立34-60
• 2.1 對(duì)象和方法35-49
• 2.1.1 樣本來源35
• 2.1.2 試劑及溶液配制和設(shè)備說明35-37
• 2.1.3 糞便懸液及血清的制備37
• 2.1.4 HEV RNA的提取37-38
• 2.1.5 HEV RNA熒光定量RT-PCR檢測(cè)體系的建立38-44
• 2.1.6 逆轉(zhuǎn)錄巢式PCR方法檢測(cè)HEV RNA44-48
• 2.1.7 考評(píng)血清盤及質(zhì)控血清品的初步構(gòu)建48-49
• 2.1.8 核酸序列分析及生物進(jìn)化樹分析49
• 2.2 結(jié)果49-56
• 2.2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立49-51
• 2.2.2 靈敏度最低檢出限51-52
• 2.2.3 精密度(重復(fù)性)驗(yàn)證52-53
• 2.2.4 特異度驗(yàn)證53
• 2.2.5 Real time RT-PCR與RT-nPCR檢測(cè)方法的對(duì)比53-54
• 2.2.6 血清盤制備情況54-55
• 2.2.7 南京地區(qū)戊肝患者分子流行病學(xué)分析55-56
• 2.3 討論56-59
• 2.4 小結(jié)59-60
• 三、RT-LAMP檢測(cè)技術(shù)在HEV RNA檢測(cè)技術(shù)中的應(yīng)用60-74
• 3.1 對(duì)象和方法60-66
• 3.1.1 標(biāo)本來源60-61
• 3.1.2 試劑及設(shè)備61
• 3.1.3 RT-LAMP技術(shù)原理及操作步驟61-65
• 3.1.4 RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HEV RNA靈敏度及特異度分析65-66
• 3.1.5 臨床樣本驗(yàn)證RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HEV RNA的有效性66
• 3.2 結(jié)果66-70
• 3.2.1 RT-LAMP技術(shù)檢測(cè)HEV RNA的方法的建立66-67
• 3.2.2 靈敏度及特異度分析67-69
• 3.2.3 臨床標(biāo)本驗(yàn)證分析69-70
• 3.3 討論70-72
• 3.4 小結(jié)72-74
• 全文結(jié)論74-75
• 論文創(chuàng)新點(diǎn)75-76
• 參考文獻(xiàn)76-81
• 發(fā)表論文和參加科研情況說明81-83
• 綜述 我國戊型肝炎流行、診斷與防治的研究進(jìn)展83-106
• 綜述參考文獻(xiàn)99-106
• 致謝106-107
• 個(gè)人簡(jiǎn)歷107

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