本文關(guān)鍵詞：Cathelicidin相關(guān)抗菌肽（CRAMP）在炎性腸病及哮喘小鼠模型中的免疫調(diào)控作用與機(jī)制

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【摘要】：Cathelicidin是一類廣泛存在于脊椎動物體內(nèi)的生物活性多肽,不同物種來源的家族成員cathelin區(qū)域高度保守。人與小鼠只發(fā)現(xiàn)一種Cathelicidin,分別命名為LL-37與CRAMP,兩者在結(jié)構(gòu)、功能和組織分布等方面極為相似。針對LL-37/CRAMP的研究主要集中于其廣譜抗微生物活性,顯示其在抗感染中發(fā)揮直接殺傷、抑制作用。近年的研究表明,LL-37/CRAMP還作為重要的免疫調(diào)節(jié)分子發(fā)揮功能,在炎癥、自身免疫病以及腫瘤等疾病中參與調(diào)控免疫病理過程。然而,LL-37/CRAMP的作用具有多重性,例如,可通過促進(jìn)炎性細(xì)胞激活與浸潤表現(xiàn)促炎癥作用,也可阻斷TLR激活而發(fā)揮炎癥抑制作用；此外,在不同的疾病中表現(xiàn)出疾病惡化或保護(hù)作用。因此,在不同疾病的特異病理微環(huán)境下研究LL-37/CRAMP的免疫調(diào)控作用,對于深入了解其病理生理功能、探討新的疾病干預(yù)手段具有重要意義。本課題旨在利用小鼠模型,研究CRAMP在哮喘和炎性腸病中的可能作用,揭示其在不同病理微環(huán)境下的功能調(diào)控機(jī)制,并探討以其為靶點(diǎn)的治療干預(yù)策略在炎癥疾病中的應(yīng)用潛能。研究主要包括：1.通過基于巨噬細(xì)胞RAW264.7的體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)以及經(jīng)鼻腔給予小鼠外源性CRAMP的動物體內(nèi)實(shí)驗(yàn),顯示合成的CRAMP可抑制LPS刺激RAW264.7產(chǎn)生TNF,在體內(nèi)可誘導(dǎo)氣道炎性細(xì)胞浸潤及炎性細(xì)胞因子表達(dá)；2.以卵清蛋白(OVA)成功誘導(dǎo)了小鼠急性哮喘模型,外源性給予CRAMP影響了氣道炎性細(xì)胞因子水平、炎性細(xì)胞浸潤、過敏原特異抗體應(yīng)答類型與水平、以及肺組織病理變化,顯示CRAMP能夠加重過敏性氣道炎癥；3.分別以TNBS及Oxazolone誘導(dǎo)了克隆氏病與結(jié)腸炎兩種小鼠炎性腸病模型,顯示CRAMP在兩種不同T細(xì)胞應(yīng)答病理機(jī)制主導(dǎo)的腸炎模型中具有顯著不同的表達(dá)水平,提示可能存在不同的病理角色；4.外源性CRAMP經(jīng)直腸給藥對Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠腸炎進(jìn)行干預(yù),能夠通過下調(diào)炎性細(xì)胞及炎性細(xì)胞因子水平、上調(diào)組織損傷修復(fù)相關(guān)基因表達(dá)水平等,起到治療性效果,但未影響T細(xì)胞亞型應(yīng)答；5.以CRAMP經(jīng)腹腔給藥,下調(diào)了炎性細(xì)胞因子水平及炎性細(xì)胞的浸潤,但顯著增加Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠體重?fù)p失與死亡；6.成功構(gòu)建了基于HBcAg病毒樣顆粒的抗CRAMP疫苗,通過免疫小鼠獲得抗血清并經(jīng)尾靜脈注射對Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠腸炎進(jìn)行被動免疫干預(yù)以拮抗異常增高的內(nèi)源性CRAMP,未發(fā)現(xiàn)顯著影響小鼠腸炎,提示CRAMP主要是通過影響腸上皮修復(fù)而非影響適應(yīng)性T細(xì)胞炎癥免疫反應(yīng)發(fā)揮作用。本研究結(jié)果顯示,抗菌肽CRAMP顯著惡化過敏原誘導(dǎo)的氣道炎癥反應(yīng),而局部的外源性的CRAMP給藥顯著抑制了腸道炎癥反應(yīng)。研究結(jié)果強(qiáng)烈提示,靶向CRAMP的治療性干預(yù)需要考慮具體的疾病環(huán)境與免疫病理機(jī)制；此外,外源性CRAMP局部應(yīng)用可能成為臨床治療炎性腸病的新的有效手段。
【關(guān)鍵詞】：CRAMP 炎性腸病 哮喘 動物模型
【學(xué)位授予單位】：北京協(xié)和醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R-332;R574;R562.25
【目錄】：

• 中文摘要6-8
• Abstract8-10
• 前言10-18
• 1. CRMP的生物學(xué)功能和特點(diǎn)10-12
• 2. 哮喘的危害、病理學(xué)機(jī)制及CRAMP/LL37的可能角色12-14
• 3. 炎性腸病的危害、病理學(xué)機(jī)制及CRAMP/LL37的可能角色14-16
• 4. 研究思路、目的及意義16-18
• 第一部分 CRAMP在小鼠哮喘急性模型中的干預(yù)研究18-40
• 1. 引言18-20
• 2. 試驗(yàn)材料與方法20-29
• 2.1. 實(shí)驗(yàn)材料20-22
• 2.1.1. 試驗(yàn)動物20
• 2.1.2. 細(xì)胞系20
• 2.1.3. 主要試劑及耗材20-21
• 2.1.4. 主要儀器21-22
• 2.2. 試驗(yàn)方法22-29
• 2.2.1. CRAMP刺激RAW264.7細(xì)胞22
• 2.2.2. 小鼠脾淋巴細(xì)胞的分離22-23
• 2.2.3. CRAMP滴鼻免疫23
• 2.2.4. 急性哮喘模型的建立23
• 2.2.5. 急性哮喘模型的CRAMP干預(yù)23
• 2.2.6. 肺灌洗液的采集和肺部浸潤細(xì)胞計(jì)數(shù)23-24
• 2.2.7. 采血和血清制備24
• 2.2.8. 肺灌洗液細(xì)胞因子檢測24-25
• 2.2.9. 血清IgG1與IgG2a的檢測25-26
• 2.2.10. OVA的Biotin標(biāo)記及血清中OVA特異的IgE檢測26-27
• 2.2.11. 肺組織切片,H&E染色及PAS染色27
• 2.2.12. 肺組織切片的半定量打分27-29
• 3. 結(jié)果與分析29-37
• 3.1. 合成肽CRAMP生物活性評價(jià)29-31
• 3.1.1. CRAMP顯著抑制LPS刺激RAW264-7產(chǎn)生TNF-α29
• 3.1.2. CRAMP促進(jìn)小鼠氣道炎性細(xì)胞浸潤及炎性細(xì)胞因子產(chǎn)生29-31
• 3.2. 外源性CRAMP惡化OVA誘導(dǎo)的小鼠急性哮喘炎性應(yīng)答31-37
• 3.2.1. 模型建立及干預(yù)流程31
• 3.2.2. CRAMP加重哮喘模型中炎性細(xì)胞的募集31-32
• 3.2.3. CRAMP顯著促進(jìn)哮喘模型小鼠氣道炎性細(xì)胞因子的產(chǎn)生32-33
• 3.2.4. CRAMP對IgG1/IgG2a的應(yīng)答偏向無顯著影響33-34
• 3.2.5. CRAMP促進(jìn)OVA特異的IgE產(chǎn)生34-35
• 3.2.6. CRAMP加重OVA誘導(dǎo)的小鼠肺部炎癥35-37
• 4. 討論37-39
• 4.1. 合成肽CRAMP具有良好的體內(nèi)和體外生物活性37-38
• 4.2. CRAMP對哮喘模型小鼠細(xì)胞因子表達(dá)的影響38
• 4.3. CRAMP對OVA誘導(dǎo)的氣道炎癥的影響38-39
• 5. 小結(jié)39-40
• 第二部分 CRAMP在小鼠炎性腸病模型中的干預(yù)研究40-95
• 1. 引言40-42
• 2. 試驗(yàn)材料與方法42-59
• 2.1 試驗(yàn)材料42-43
• 2.1.1. 試驗(yàn)動物42
• 2.1.2. 試劑及耗材42-43
• 2.2. 試驗(yàn)方法43-59
• 2.2.1. Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠潰瘍性結(jié)腸炎模型43
• 2.2.2. TNBS誘導(dǎo)的小鼠克隆氏病腸炎模型43
• 2.2.3. CRAMP直腸給藥對小鼠Oxazolone腸炎模型的干預(yù)43-44
• 2.2.4. CRAMP腹腔給藥對小鼠Oxazolone腸炎模型的干預(yù)44
• 2.2.5. CRAMP腹腔給藥對小鼠TNBS腸炎模型的干預(yù)44
• 2.2.6. 小鼠腸組織取材44-45
• 2.2.7. 用于ELISA檢測的腸組織勻漿液的制備45
• 2.2.8. 腸組織勻漿液的細(xì)胞因子ELISA檢測45-46
• 2.2.9. 腸組織總RNA提取46
• 2.2.10. 腸組織mRNA的逆轉(zhuǎn)錄及Real-time PCR檢測46-48
• 2.2.11. 腸組織切片及H&E染色48
• 2.2.12. 腸組織切片的半定量打分48-49
• 2.2.13. CRAMP刺激小鼠脾細(xì)胞的XTT檢測49
• 2.2.14. 血清制備及血清中LPS的含量檢測49-50
• 2.2.15. 腸組織MPO檢測50
• 2.2.16. 脾淋巴細(xì)胞Th流式檢測50-51
• 2.2.17. 脾淋巴細(xì)胞Treg流式檢測51
• 2.2.18. 重組嵌合抗肽疫苗質(zhì)粒的構(gòu)建51-54
• 2.2.19. 重組嵌合抗肽疫苗的表達(dá)純化54-56
• 2.2.20. 化學(xué)偶聯(lián)抗肽疫苗的構(gòu)建56
• 2.2.21. 抗CRAMP疫苗的小鼠免疫56-57
• 2.2.22. 抗肽疫苗免疫后的抗血清檢測57-58
• 2.2.23. 抗肽血清被動免疫干預(yù)Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠腸炎58-59
• 3. 結(jié)果與分析59-86
• 3.1. CRAMP及其受體Fpr2在不同炎性腸病模型小鼠腸組織中的表達(dá)59-60
• 3.2. CRAMP經(jīng)直腸給藥緩解了Oxazolone誘導(dǎo)的小鼠腸炎60-73
• 3.2.1. 模型建立及干預(yù)流程60
• 3.2.2. CRAMP提高模型小鼠生存率60-61
• 3.2.3. CRAMP促進(jìn)模型小鼠體重恢復(fù)61-62
• 3.2.4. CRAMP顯著降低模型小鼠腸組織單位長度的重量62-63
• 3.2.5. CRAMP顯著抑制模型小鼠腸組織炎性細(xì)胞因子的表達(dá)63-66
• 3.2.6. CRAMP引起模型小鼠腸組織IFN-γ高表達(dá)66
• 3.2.7. CRAMP不影響IL-33表達(dá)水平66-67
• 3.2.8. CRAMP促進(jìn)模型小鼠腸組織中組織修復(fù)相關(guān)基因的高表達(dá)67-68
• 3.2.9. CRAMP抑制模型小鼠腸組織中嗜中性粒細(xì)胞趨化因子表達(dá)68-69
• 3.2.10. CRAMP顯著緩解模型小鼠腸上皮損傷與組織炎癥69-71
• 3.2.11. CRAMP增加模型小鼠腸組織中MPO水平71-72
• 3.2.12. CRAMP不影響小鼠脾細(xì)胞中T細(xì)胞水平72-73
• 3.3. 外源性CRAMP經(jīng)腹腔給藥對不同小鼠炎性腸病模型的作用73-81
• 3.3.1. 模型建立及干預(yù)流程73
• 3.3.2. CRAMP不引起正常小鼠的明顯毒性反應(yīng)73-74
• 3.3.3. CRAMP降低Oxazolone而非TNBS誘導(dǎo)的炎性腸病模型小鼠生存率74-75
• 3.3.4. CRAMP顯著惡化Oxazolone而非TNBS誘導(dǎo)的模型小鼠體重下降75-76
• 3.3.5. CRAMP未引起腸單位長度重量的顯著變化76
• 3.3.6. CRAMP抑制Oxazolone誘導(dǎo)小鼠細(xì)胞因子mRNA表達(dá)但未影響蛋白水平76-79
• 3.3.7. CRAMP抑制Oxazolone誘導(dǎo)小鼠腸組織中組織修復(fù)相關(guān)因子表達(dá)79-80
• 3.3.8. CRAMP引起正常小鼠腹腔中以嗜中性粒細(xì)胞為主的炎性細(xì)胞聚集80-81
• 3.3.9. CRAMP不影響血清中LPS水平81
• 3.4. 抗CRAMP疫苗構(gòu)建及抗血清被動免疫干預(yù)Oxazolone誘導(dǎo)的腸炎81-86
• 3.4.1. 重組嵌合抗CRAMP VLPs疫苗的構(gòu)建82-83
• 3.4.2. 化學(xué)偶聯(lián)抗CRAMP疫苗的構(gòu)建83-84
• 3.4.3. 抗血清的制備及檢測84
• 3.4.4. 抗血清被動免疫Oxazolone誘導(dǎo)的炎性腸病模型小鼠84-85
• 3.4.5. CRAMP不影響鼠脾細(xì)胞的增殖85-86
• 4. 討論86-93
• 4.1. CRAMP經(jīng)直腸給藥途徑對腸炎的治療潛能87-89
• 4.2. 腹腔給藥途徑對CRAMP針對炎性腸病治療應(yīng)用的影響89-93
• 5. 小結(jié)93-95
• 5.1. CRAMP經(jīng)直腸給藥對腸炎的治療潛能93
• 5.2. 腹腔給藥途徑對CRAMP針對炎性腸病治療應(yīng)用的影響93-95
• 全文討論95-97
• 展望97-99
• 參考文獻(xiàn)99-104
• 附錄104-108
• 致謝108-109
• 個人簡介109-111

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本文編號：941281