本文關(guān)鍵詞：咖啡因?qū)Π唏R魚脂肪肝的保護作用及其機制的初步研究

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【摘要】：研究背景和目的非酒精性脂肪性肝臟疾病(NAFLD)是引起慢性肝臟疾病最常見的致病因素之一。據(jù)估計在西方國家大約20-30%成年人和3-10%兒童青少年存在肝內(nèi)脂肪過度聚集。最新的系統(tǒng)評價結(jié)果顯示在中國NAFLD的患病率大約20.09%,男性患病率為24.81%,女性患病率為13.16%。隨著世界范圍內(nèi)肥胖及其相關(guān)并發(fā)癥如糖尿病、胰島素抵抗和高脂血癥的流行,NAFLD的發(fā)生率在最近幾十年逐漸升高。事實上,NAFLD目前被看作是代謝綜合征在肝臟內(nèi)的病理體現(xiàn),其病變程度包括從非進展的單純性脂肪變性到伴隨氣球樣變性、炎癥浸潤或肝纖維化的非酒精性脂肪性肝炎(NASH)。經(jīng)過幾十年的演變,NASH可進展為肝硬化,甚至最終可能發(fā)展為肝癌。由于NAFLD的發(fā)病分子機制并未完全闡明,目前的主要治療策略是改變生活飲食習(xí)慣和增加身體運動,避免長期靜坐。許多實驗研究已通過利用飲食誘導(dǎo)、藥物誘導(dǎo)和遺傳操作方法在嚙齒動物中嘗試建立NAFLD模型。近年來由于斑馬魚比嚙齒動物具有繁殖率高,成熟早,體積小,維護和飼養(yǎng)成本低的特點,斑馬魚成為新的實驗動物為研究人員所青睞。越來越多的研究人員利用斑馬魚作為疾病模型來研究NAFLD的發(fā)病機理和藥物治療。在一篇綜述里Yoichi Asaoka等人概括總結(jié)了用于研究NAFLD的各種魚類模型包括突變的、轉(zhuǎn)基因的、飲食誘導(dǎo)的和化學(xué)藥物處理誘導(dǎo)的模型,并且與嚙齒動物模型進行了比較。Valerie Sapp等人最近利用受精后7天的斑馬魚幼魚建立了果糖誘導(dǎo)的斑馬魚NASH模型。然而,以往利用斑馬魚模型進行的NAFLD研究大多數(shù)是聚焦在受精后5-7天斑馬魚和成熟的斑馬魚,而對于青少年時期的斑馬魚的NALFD模型目前尚未有探索�；诎唏R魚樣本量大和在青少年期其身體具有透明性適于運用整體油紅O染色來確定其肝內(nèi)脂質(zhì)聚集的優(yōu)點,在本研究中我們試圖建立青少年期斑馬魚是否可作為飲食誘導(dǎo)的斑馬魚NAFLD模型�？Х瓤赡苁鞘澜缟献畛ｏ嬘玫娘嬃�。由于世界范圍內(nèi)許多國家消費咖啡,無論從公眾和科學(xué)研究的視角而言,研究咖啡對人類潛在利與弊都是值得關(guān)注的�？Х纫蚴强Х鹊闹饕煞�,咖啡也含有其他成分如二萜醇、鉀、煙酸、鎂和抗氧化劑綠原酸(CGA)、生育酚等。盡管咖啡和咖啡因能增加患心血管疾病的風(fēng)險,但是越來越多的證據(jù)表明咖啡和咖啡因?qū)β愿闻K疾病具有肝臟保護作用。流行病學(xué)和臨床研究已表明飲用咖啡和咖啡因可降低酒精性肝硬化、2型糖尿病、NAFLD和肝癌的發(fā)生,減緩NASH的進展和降低肝纖維化的嚴重性及肝損傷患者ALT的活性。許多動物和體外實驗研究顯示咖啡和咖啡因?qū)Ω闻K損傷具有保護作用。Sandra kal thoff等人證明咖啡通過上調(diào)肝內(nèi)和胃中尿苷二磷酸葡萄醛酸轉(zhuǎn)移酶表達介導(dǎo)肝保護和抗氧化特性。動物實驗研究顯示咖啡因能通過抑制轉(zhuǎn)化生長因子p(TGF-p)和其下游效應(yīng)分子減輕肝硬化和肝癌的發(fā)生�？Х纫蛞部赏ㄟ^激活自噬溶酶體通路降低肝內(nèi)脂質(zhì)含量和激活肝細胞內(nèi)脂質(zhì)p-氧化。類似的研究表明在HepG2細胞中咖啡因可通過調(diào)控AMPK-SREBP信號通路抑制脂質(zhì)形成和激活脂質(zhì)分解而有效地降低甘油三酯和膽固醇含量。盡管咖啡和咖啡因?qū)AFLD顯示出肝臟保護作用特性,但是其確切機制并未完全明確。本研究通過建立飲食誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚NAFLD模型,同時探討咖啡因?qū)Π唏R魚幼魚肝內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響及可能的機制。從而為研究NAFLD的發(fā)病機制和治療藥物的篩選提供實驗?zāi)Ｐ�。方�?、確定斑馬魚幼魚發(fā)生脂肪肝的最適喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間由于斑馬魚具有嗜食性的特點,我們將受精后5天(5dpf)斑馬魚幼魚分為6個不同喂養(yǎng)量組(20mg/d、30mg/d、60mg/d、80mg/d、120mg/d和 180mg/d),3個不同喂養(yǎng)時間(10天、15天和20天),每組100條幼魚。通過測量幼魚的體重和體長評估不同喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間幼魚的生長情況,同時統(tǒng)計不同組幼魚的死亡率。利用整體油紅O染色、冰凍切片油紅O染色和HE染色評估不同喂養(yǎng)組和喂養(yǎng)時間斑馬魚幼魚脂肪肝發(fā)生率和肝臟病理學(xué)的變化。進一步通過檢測幼魚體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇含量,觀察不同喂養(yǎng)組幼魚體內(nèi)脂質(zhì)含量的變化。根據(jù)斑馬魚幼魚生長情況、肝臟病理學(xué)改變和體內(nèi)脂質(zhì)變化,從而確定誘導(dǎo)斑馬魚脂肪肝的最適喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間,為后續(xù)評估咖啡因?qū)χ靖蔚淖饔锰峁┠Ｐ汀?、探討咖啡因(caffeine)對飲食誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚肝脂肪變性的影響為研究咖啡因?qū)Π唏R魚肝內(nèi)脂質(zhì)聚集的影響,我們將咖啡因添加到幼魚食物中,將幼魚分為1%caffeine、2.5%caffeine、5%caffeine、8%caffeine、正常喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組,喂養(yǎng)20天。測量不同喂養(yǎng)組幼魚體重變化情況,整體油紅O染色評估各組斑馬魚幼魚脂肪肝發(fā)生率,接著冰凍切片油紅O染色和HE染色評估不同喂養(yǎng)濃度咖啡因?qū)τ佐~肝臟脂肪變性的影響。此外,測量各組斑馬魚幼魚體內(nèi)甘油三酯和總膽固醇的水平,評估咖啡因?qū)τ佐~體內(nèi)脂質(zhì)的影響。3、初步探討咖啡因(caffeine)減輕斑馬魚幼魚脂肪肝的可能機制本研究主要通過實時熒光定量PCR技術(shù)(qRT-PCR)在轉(zhuǎn)錄水平研究相關(guān)基因的表達水平。應(yīng)用該方法我們檢測咖啡因?qū)τ佐~肝內(nèi)脂質(zhì)代謝相關(guān)基因(PPAR-γ、SREBP1、PPAR-α、ACC1、FASN、CD36、UCP2、CPT-1和ACO)、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激相關(guān)基因(ATF6、IRE1、PERK、BIP和CHOP)、炎癥相關(guān)基因(IL-1β、TNF-α和NF-κB)和自噬相關(guān)基因(Beclin-1、ATG12和ATG3)的表達影響。4、尼羅紅熒光染色活體標(biāo)記和成像過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂滴和體內(nèi)脂肪組織由于斑馬魚幼魚身體具有透明可視性,我們通過利用尼羅紅熒光染料標(biāo)記中性脂質(zhì)的特性,在斑馬魚幼魚體內(nèi)活體標(biāo)記和成像過度喂養(yǎng)幼魚肝內(nèi)脂滴聚集和體內(nèi)脂肪組織。同時利用尼羅紅熒光染色方法動態(tài)觀察不同喂養(yǎng)時間幼魚體內(nèi)脂肪組織的分布和肝內(nèi)脂滴變化。此外,在饑餓和饑餓后喂養(yǎng)條件下,利用該方法活體觀察過度喂養(yǎng)的幼魚體內(nèi)脂肪組織和肝內(nèi)脂滴的動態(tài)變化。結(jié)果1、過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚明顯發(fā)生了脂肪肝通過測量不同喂養(yǎng)量和喂養(yǎng)時間幼魚的體重和體長,結(jié)果分析顯示幼魚體重和體長隨著每日喂養(yǎng)量的增加逐漸增加,喂養(yǎng)20天幼魚體重(2.063±1.624mg)明顯比喂養(yǎng)15天幼魚(1.108±0.7363mg)重(P0.001)。同樣地喂養(yǎng)20天幼魚體長(6.587±1.220mm)比喂養(yǎng)10天幼魚(4.885±0.5879mm)和喂養(yǎng)15天幼魚(5.594±0.7336mm)明顯長(P0.001)。然而,不同喂養(yǎng)組之間幼魚的死亡率并沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)；喂養(yǎng)15天(19.25%)和喂養(yǎng)20天(21.47%)幼魚死亡率明顯比喂養(yǎng)10天幼魚(7.83%)高(P0.01),而喂養(yǎng)15天幼魚死亡率與喂養(yǎng)20天幼魚死亡率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。這些數(shù)據(jù)表明幼魚死亡率與每日喂養(yǎng)量無關(guān),而是取決于幼魚本身內(nèi)在的因素。整體油紅O染色方法評估顯示,隨著喂養(yǎng)量的增加,幼魚脂肪變性率逐漸升高；在每天喂養(yǎng)量120mg/d組和180mg/d喂養(yǎng)組幼魚脂肪肝發(fā)生率可達80%以上,但是在不同喂養(yǎng)時間組之間幼魚脂肪肝發(fā)生率無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。整體油紅O染色、冰凍切片油紅O染色和HE染色顯示幼魚喂養(yǎng)10天后出現(xiàn)肝內(nèi)脂滴聚集,并且當(dāng)幼魚喂養(yǎng)到15天和20天后肝內(nèi)脂滴數(shù)量增多,體積增大。然而,每日喂養(yǎng)量為20mg/d或30mg/d組幼魚肝臟基本上沒有脂質(zhì)聚集,表明該喂養(yǎng)量能維持幼魚正常的能量需要。而每日喂養(yǎng)量為120mg/d或180mg/d組幼魚顯示肝內(nèi)大量的脂滴聚集,這表明在該喂養(yǎng)量條件下幼魚處于能量過剩狀態(tài)。此外,檢測斑馬魚幼魚體內(nèi)甘油三酯(TG)和總膽固醇(TCH)的含量,結(jié)果表明180mg/d喂養(yǎng)組幼魚喂養(yǎng)20天體內(nèi)TG含量(0.0142±0.0035mmol/gprotein)明顯比30mg/d喂養(yǎng)組幼魚體內(nèi)TG含量(0.0073±0.0034mmol/gprotein)高(P0.01)),而兩組之間總膽固醇(TCH)含量并沒有統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。因此,這些數(shù)據(jù)表明在過度喂養(yǎng)條件下斑馬魚幼魚易于發(fā)生肝臟脂肪變性,同時表明我們成功地建立了過度喂養(yǎng)誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚脂肪肝模型,并將喂養(yǎng)量為30mg/d,喂養(yǎng)20天的幼魚定位正常喂養(yǎng)組,而喂養(yǎng)量180mg/d,喂養(yǎng)20天的幼魚為過度喂養(yǎng)組。2、咖啡因降低過度喂養(yǎng)斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂質(zhì)的聚集許多流行病學(xué)和臨床證據(jù)已表明咖啡和咖啡因?qū)β愿闻K疾病具有保護作用,因此我們研究咖啡因在過度喂養(yǎng)的斑馬魚幼魚中是否具有降低肝內(nèi)脂肪聚集的作用。首先,我們評估了咖啡因?qū)τ佐~體重的影響。我們發(fā)現(xiàn)在2.5%、5%和8%caffeine喂養(yǎng)組幼魚體重中比過度喂養(yǎng)組幼魚體重明顯減輕,但是在1%caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組之間幼魚體重沒有明顯差別。正如幼魚體重一樣,2.5%、5%、8%caffeine喂養(yǎng)組幼魚脂肪肝發(fā)生率和TG含量與過度喂養(yǎng)組比較明顯降低,而1%caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組之間無差異。同時各不同喂養(yǎng)組之間總膽固醇含量并沒有統(tǒng)計學(xué)差異。接著連續(xù)冰凍切片HE染色和油紅O染色結(jié)果顯示2.5%、5%和8%caffeine喂養(yǎng)組幼魚肝內(nèi)脂滴數(shù)量和脂滴體積比1%caffeine喂養(yǎng)組和過度喂養(yǎng)組幼魚明顯減少。這些數(shù)據(jù)表明咖啡因能減輕過度喂養(yǎng)誘導(dǎo)的幼魚肝內(nèi)脂質(zhì)聚集。3、咖啡因參與調(diào)控脂質(zhì)代謝通路、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(ER)應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)的基因表達為了探索咖啡因減輕肝內(nèi)脂滴聚集的可能機制,我們檢測了參與調(diào)控脂質(zhì)代謝基因的表達水平。qPCR結(jié)果顯示與過度喂養(yǎng)組幼魚相比,參與脂肪酸攝入的轉(zhuǎn)運蛋白的基因表達水平在5%caffeine喂養(yǎng)組中明顯的降低,如脂肪酸轉(zhuǎn)運酶基因(FAT/CD36);解耦聯(lián)蛋白-2(UCP-2)基因和參與脂質(zhì)形成的轉(zhuǎn)錄因子基因如固醇調(diào)節(jié)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子-1(SREBP-1)表達水平也降低；參與脂肪酸合成的關(guān)鍵酶乙酰CoA羧化酶-1(ACC1)和脂肪酸合成酶(FASN)表達含量也明顯降低。然而,參與脂肪酸β-氧化過程的乙酰CoA氧化酶(ACO)基因表達水平在5%caffeine喂養(yǎng)組中明顯升高。接著我們在過度喂養(yǎng)的幼魚中探索咖啡因是否能影響ER功能而發(fā)揮保護肝臟的作用。qRT-PCR結(jié)果顯示過度喂養(yǎng)組組中參與ER應(yīng)激的基因表達水平明顯比對照組(30mg/d)升高,包括基因IRE1、BIP和CHOP�？Х纫蛭桂B(yǎng)后,基因BIP和IREl表達量明顯下降,并且ATF6和PERK的mRNA水平在咖啡因喂養(yǎng)組中也明顯降低,這表明咖啡因可下調(diào)參與ER應(yīng)激的相關(guān)基因。進一步我們檢測了炎癥因子基因的表達水平,觀察咖啡因是否可調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)。結(jié)果顯示與正常喂養(yǎng)組比較,過度喂養(yǎng)組幼魚肝組織中炎癥因子IL-1β和TNF-α表達含量明顯增加；而5%caffeine喂養(yǎng)后其表達含量又明顯降低；NF-κB的表達量各組之間沒有差異。除此之外,咖啡因處理后自噬相關(guān)基因ATG12和Beclin-1的表達水平降低。因此,這些結(jié)果表明咖啡因可能通過抑制脂質(zhì)形成和脂肪酸攝入,改善內(nèi)置網(wǎng)功能及減輕肝內(nèi)炎癥反應(yīng)而減輕幼魚肝內(nèi)的脂質(zhì)聚集。4、尼羅紅染色活體標(biāo)記和成像過度喂養(yǎng)幼魚肝內(nèi)脂滴和體內(nèi)脂肪細胞我們選擇過度喂養(yǎng)20天幼魚,經(jīng)過尼羅紅染液處理后,在熒光顯微鏡下觀察。結(jié)果發(fā)現(xiàn)在幼魚肝內(nèi)和腹腔部位有明顯的強烈桔黃色信號,表明幼魚存在肝內(nèi)脂滴和腹腔脂肪細胞聚集。同時整體油紅O染色,白光顯微鏡和HE切片進一步證實肝內(nèi)脂滴和腹部脂肪細胞的存在。接著我們運用尼羅紅染色觀察不同喂養(yǎng)時間幼魚體內(nèi)脂肪組織的發(fā)生和分布。尼羅紅染色結(jié)果顯示5dpf斑馬魚幼魚還未被完全吸收的卵黃囊。過度喂養(yǎng)2天的幼魚(即9dpf)胰腺位置出現(xiàn)中性脂質(zhì)聚集,表明脂肪細胞最先出現(xiàn)在胰腺部位；喂養(yǎng)5天的幼魚(12dpf)腹腔中開始出現(xiàn)小脂滴,提示存在脂肪細胞聚集：而隨著喂養(yǎng)時間延長腹腔脂肪細胞聚集明顯增多,脂肪細胞出現(xiàn)的部位除腹腔外,還出現(xiàn)在其他部位如胸鰭部,眼眶周圍,尾鰭部,心包周圍,下頜部,皮下和背部。這表明隨著喂養(yǎng)時間延長斑馬魚體內(nèi)脂肪細胞數(shù)量和出現(xiàn)部位逐漸增加,說明不同部位脂肪組織的發(fā)生并不是同步的,斑馬魚脂肪組織的形成按一定的順序存在時間和空間上的調(diào)控。此外,發(fā)現(xiàn)在過度喂養(yǎng)下斑馬魚肝臟在喂養(yǎng)5天后可出現(xiàn)明顯的脂質(zhì)聚集,之后肝內(nèi)脂質(zhì)聚集一直存在,表明斑馬魚易于發(fā)生肝內(nèi)脂質(zhì)聚集。接著我們運用尼羅紅縱向觀察饑餓后斑馬魚脂肪組織和肝內(nèi)脂滴變化。首先,尼羅紅染色過度喂養(yǎng)的27dpf斑馬魚顯示腹腔內(nèi)脂肪細胞聚集和肝內(nèi)脂滴形成。而在斑馬魚饑餓1、2和4天后,腹腔脂肪組織明顯逐漸減少,肝臟體積和肝內(nèi)脂滴數(shù)量也逐漸減少。在饑餓5天后,腹腔內(nèi)脂肪組織和肝內(nèi)脂滴基本消失,表明在饑餓狀態(tài)時,斑馬魚動用脂肪組織的脂肪和肝內(nèi)脂質(zhì)維持能量供應(yīng)。為了證明斑馬魚在重新給予喂養(yǎng)后脂肪組織重新出現(xiàn),我們對饑餓5天后斑馬魚給予喂養(yǎng)。尼羅紅染色發(fā)現(xiàn)喂養(yǎng)2天后,斑馬魚腹腔內(nèi)又出現(xiàn)小脂滴,在重新喂養(yǎng)5天后,斑馬魚腹腔內(nèi)中性脂質(zhì)明顯增加,而肝內(nèi)脂滴變化不是很明顯。這表明饑餓的斑馬魚重新喂養(yǎng)后,脂肪細胞可重新聚集脂質(zhì)。結(jié)論1、成功建立飲食的誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚脂肪肝模型,為研究NAFLD發(fā)病機制和治療藥物的篩選提供新的動物模型。2、咖啡因可通過降低脂肪酸攝入、脂質(zhì)合成和炎癥相關(guān)因子基因的表達,上調(diào)脂質(zhì)氧化相關(guān)基因,同時改善內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能而減輕斑馬魚幼魚肝內(nèi)脂質(zhì)的聚集。3、尼羅紅熒光染色活體標(biāo)記和成像斑馬魚幼魚體內(nèi)脂肪組織和肝內(nèi)脂滴,為活體觀察體內(nèi)脂肪組織的發(fā)育和肝內(nèi)脂質(zhì)聚集提供良好的實驗方法。
【關(guān)鍵詞】：斑馬魚 脂肪肝 咖啡因 尼羅紅 脂肪組織 活體成像
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要3-10
• ABSTRACT10-21
• 前言21-27
• 第一章 斑馬魚幼魚脂肪肝模型的建立27-45
• 1.1 實驗材料、試劑和主要設(shè)備27-28
• 1.2 實驗方法28-35
• 1.3 實驗結(jié)果35-43
• 1.4 實驗討論43-45
• 第二章 探討咖啡因(CAFFEINE)對斑馬魚幼魚脂肪肝的作用45-58
• 2.1 實驗材料、試劑和主要設(shè)備46-47
• 2.2 實驗方法47-51
• 2.3 實驗結(jié)果51-56
• 2.4 實驗討論56-58
• 第三章 咖啡因減輕斑馬魚脂肪肝的作用機制初步探討58-69
• 3.1 實驗材料、試劑和主要設(shè)備58-59
• 3.2 實驗方法59-62
• 3.3 實驗結(jié)果62-67
• 3.4 實驗討論67-69
• 第四章 熒光染料尼羅紅活體標(biāo)記和成像幼魚肝內(nèi)脂滴和脂肪組織69-81
• 4.1 實驗材料、試劑和主要設(shè)備69-70
• 4.2 實驗方法70-73
• 4.3 實驗結(jié)果73-78
• 4.4 實驗討論78-81
• 全文總結(jié)81-85
• 參考文獻85-92
• 縮略語中英文對照92-94
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果94-95
• 致謝95-98

【共引文獻】

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本文編號：941111