本文關(guān)鍵詞：乙肝HBx蛋白上調(diào)CD147介導(dǎo)肝纖維化的調(diào)控機(jī)制研究

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【摘要】：肝纖維化是一種由各種病因長期損傷肝臟,從而導(dǎo)致肝臟反復(fù)發(fā)生損傷-修復(fù)反應(yīng)的一種慢性肝臟疾病。大量細(xì)胞外基質(zhì)(ECM)在這個病理過程中分泌、聚集,最終導(dǎo)致了肝纖維化和肝硬化的發(fā)生。靜息的肝星狀細(xì)胞(HSC)具有儲脂、維持肝臟內(nèi)維生素A內(nèi)穩(wěn)態(tài)的功能,但當(dāng)它一旦被致纖維化因子激活后,就成為了產(chǎn)生ECM的主要效應(yīng)細(xì)胞�；罨腍SC能夠表達(dá)很多致肝纖維化的細(xì)胞外基質(zhì)蛋白,如:Ⅰ型膠原、α-平滑肌動蛋白(α-SMA)、轉(zhuǎn)化生長因子-β1(TGF-β1)、基質(zhì)金屬蛋白酶(MMP)、金屬蛋白酶組織抑制物(TIMP)等。臨床研究證明慢性乙肝病毒(HBV)感染是導(dǎo)致我國肝炎、肝硬化甚至肝癌的最主要病因。HBx蛋白作為乙肝病毒的四種編碼蛋白之一,在肝臟疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮了關(guān)鍵的作用。HBx蛋白作為一個多功能調(diào)節(jié)蛋白,具有廣泛的反式激活作用,它能通過與其他轉(zhuǎn)錄因子直接或間接的相互作用參與感染肝細(xì)胞的基因組穩(wěn)定性、細(xì)胞凋亡、蛋白降解、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞周期調(diào)控,在HBV的復(fù)制、致病和致癌機(jī)制中具有重要作用。TGF-β1被認(rèn)為是在肝纖維化的病理過程中激活HSC的主要細(xì)胞因子。檢測HBV相關(guān)的纖維化肝臟標(biāo)本,或是轉(zhuǎn)染了HBx的肝細(xì)胞的條件培養(yǎng)基,均可發(fā)現(xiàn)TGF-β1表達(dá)顯著增高。研究發(fā)現(xiàn)在肝癌細(xì)胞中,HBx能夠通過與TGF-β1基因啟動子的Egr-1位點結(jié)合從而在轉(zhuǎn)錄水平上激活TGF-β1的表達(dá)。CD147分子是一個跨膜糖蛋白,屬于免疫球蛋白超家族的一員。它廣泛的表達(dá)于各種炎癌組織,而在正常組織中不表達(dá)或低表達(dá)。我們之前的研究證實了該分子高表達(dá)于人類肝硬化組織的竇周隙和tgf-β1刺激后的肝星狀細(xì)胞,但其具體的調(diào)控和分子機(jī)制尚未得到揭示。在本研究中,我們提出了以下假設(shè):hbv感染肝細(xì)胞后,hbx刺激肝細(xì)胞旁分泌tgf-β1,tgf-β1與hsc的tgf-β1受體結(jié)合后,活化經(jīng)典的smad信號通路,誘導(dǎo)cd147表達(dá);cd147表達(dá)上調(diào)激活hsc,促進(jìn)hbv相關(guān)肝纖維化的發(fā)展。為了證明這個假設(shè),我們的研究分為以下3部分:第一部分:hbx通過促進(jìn)tgf-β1旁分泌上調(diào)cd147活化hsc。hbx轉(zhuǎn)染人非腫瘤肝細(xì)胞系l02,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)hbx的l02-hbx細(xì)胞系。該細(xì)胞系中,不論tgf-β1的總分泌量還是活性tgf-β1量均顯著增高(p0.001)。為了證明hbx對hsc的作用,我們將l02-hbx細(xì)胞與人肝星狀細(xì)胞系lx-2共培養(yǎng)或以l02-hbx細(xì)胞的條件培養(yǎng)基孵育lx-2細(xì)胞后,westernblot檢測到lx-2細(xì)胞的cd147表達(dá)上調(diào)。而此條件下的cd147上調(diào)表達(dá)可被tgf-β1受體阻斷劑(sb-431542)所抑制。這證明hbx通過旁分泌tgf-β1誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞cd147分子表達(dá)上調(diào)。為了證明tgf-β1能夠誘導(dǎo)hsc的cd147分子的表達(dá),我們以不同濃度的tgf-β1刺激lx-2細(xì)胞后,發(fā)現(xiàn)cd147及纖維化相關(guān)分子α-sma、α1(i)collagen、mmp-2在mrna水平和蛋白水平均呈劑量依賴性升高。為了進(jìn)一步明確cd147在激活hsc的的過程中發(fā)揮著重要的作用,我們將cd147轉(zhuǎn)染lx-2細(xì)胞,建立穩(wěn)轉(zhuǎn)cd147的lx-2-cd147細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)該細(xì)胞系中不論是上述纖維化相關(guān)分子在mrna和蛋白水平的表達(dá)上,還是細(xì)胞遷移能力(transwell小室檢測)、收縮能力(細(xì)胞收縮實驗檢測)都有顯著增強。此外,我們還發(fā)現(xiàn)ellisa檢測lx-2-cd147細(xì)胞上清后,tgf-β1的總量和活性tgf-β1均顯著上調(diào)。上述結(jié)果表明,hbx蛋白通過旁分泌tgf-β1上調(diào)hsc的cd147,cd147的上調(diào)活化了hsc,從而使ecm的合成增加,促進(jìn)肝纖維化的進(jìn)展。在這個過程中,存在著cd147-tgf-β1的正反饋環(huán)路。第二部分:hbv轉(zhuǎn)基因小鼠(hbv-tgmice)纖維化模型中cd147表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肝纖維化。不同于以往的ccl4誘導(dǎo)、膽管結(jié)扎等單因素小鼠肝纖維化模型,本實驗采用了hbv-tg小鼠模擬人類感染hbv引起的hbv相關(guān)肝纖維化。在hbv-tg小鼠模型肝臟組織中,westernblot和免疫組化結(jié)果均顯示該小鼠表達(dá)hbx蛋白;我們發(fā)現(xiàn)12個月的hbv-tg小鼠肝臟外觀明顯腫大,并出現(xiàn)不規(guī)則的結(jié)節(jié),肝臟重量明顯高于wt小鼠。檢測6個月hbv-tg小鼠的肝臟組織,he染色顯示,hbv-tg小鼠的肝臟組織有嚴(yán)重的小葉中心壞死伴中性粒細(xì)胞和單核巨噬細(xì)胞的浸潤;天狼星紅和masson三色染色均顯示膠原沉積,假小葉形成。westernblot和/或免疫組化檢測肝纖維化相關(guān)分子α-sma、α1(i)collagen、mmp-2均表達(dá)上調(diào)。這些結(jié)果說明hbv-tg小鼠在6個月即可發(fā)生自發(fā)肝纖維化。為了在體內(nèi)驗證hbv相關(guān)的肝纖維化在hsc存在cd147、tgf-β1之間的正反饋調(diào)節(jié),westernblot和免疫組化檢測hbv-tg小鼠肝臟顯示cd147和tgf-β1均高表達(dá)。免疫熒光檢測顯示,在hbv-tg小鼠肝臟組織中cd147、α-sma、tgf-β1存在三者的共定位。上述結(jié)果提示在hbv相關(guān)肝纖維化的hsc中,可能存在cd147與tgf-β1之間的正反饋調(diào)節(jié)。第三部分:在hsc中tgf-β1通過smad信號途徑上調(diào)cd147。以不同濃度tgf-β1刺激lx-2細(xì)胞系,發(fā)現(xiàn)smad2、smad3的蛋白總量沒有發(fā)生改變,但p-smad2、p-smad3表達(dá)增高。檢測hbv-tg小鼠肝臟組織的smad2、smad3、p-smad2、p-smad3同樣驗證了這一點。tgf-β1刺激前后,smad4在hsc中的表達(dá)量無明顯變化,這一點在hbv-tg小鼠中同樣得到了證實;但是激光共聚焦檢測發(fā)現(xiàn)smad4在hsc中的定位隨著tgf-β1濃度的增加,逐漸從胞漿向細(xì)胞核內(nèi)聚集。為了證明smad信號途徑對cd147的調(diào)控功能,我們分別以si-smad2、si-smad3、si-smad3作用于lx-2細(xì)胞,westernblot檢測發(fā)現(xiàn)相應(yīng)的smad被干涉后,cd147的表達(dá)均顯著下調(diào)。這些結(jié)果說明tgf-β1是通過smad蛋白協(xié)同作用誘導(dǎo)了cd147的表達(dá)。為了驗證smad4能夠直接在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控cd147的表達(dá),我們在lx-2細(xì)胞中共轉(zhuǎn)染了cd147啟動子、smad4和pgl3-basic質(zhì)粒。雙熒光素酶報告基因?qū)嶒炋崾緹晒饣钚耘csmad4的劑量呈正相關(guān),這證明smad4可以在轉(zhuǎn)錄水平調(diào)控cd147的表達(dá)。為了明確smad4調(diào)控cd147的具體結(jié)合位點,我們將cd147啟動子全長1761bp,及上游1273bp、1028bp、644bp、338bp的熒光素酶分段截短載體與smad4表達(dá)載體共轉(zhuǎn)染入lx-2細(xì)胞,實驗結(jié)果表明,smad4是通過結(jié)合啟動子-644到-338區(qū)間的sbe(smadbindingelement)來調(diào)控cd147轉(zhuǎn)錄。為了進(jìn)一步證明這一點,我們將這一區(qū)域sbe的gtct突變?yōu)間gcg,發(fā)現(xiàn)突變后的cd147啟動子的熒光活性沒有上升。染色質(zhì)免疫共沉淀(chip)也證實,轉(zhuǎn)錄因子smad4可以直接調(diào)控cd147表達(dá)。上述結(jié)果證明,tgf-β1通過調(diào)節(jié)hsc內(nèi)smad2/3的磷酸化和Smad4的定位,影響著CD147的轉(zhuǎn)錄調(diào)控;而Smad復(fù)合體通過Smad4與CD147啟動子的-644到-338區(qū)的SBE直接結(jié)合來調(diào)控CD147的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。
【關(guān)鍵詞】：CD147 HBx TGF-β1 肝纖維化
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 縮略語表6-8
• 中文摘要8-12
• ABSTRACT12-16
• 前言16-18
• 文獻(xiàn)回顧18-32
• 第一部分 HBX通過促進(jìn)TGF-Β1旁分泌上調(diào)CD147活化肝星狀細(xì)胞32-45
• 1 材料32-34
• 1.1 細(xì)胞系32
• 1.2 主要儀器設(shè)備32-33
• 1.3 主要試劑33-34
• 1.4 主要緩沖液34
• 2 方法34-39
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)34
• 2.2 HBx瞬時/穩(wěn)定轉(zhuǎn)染34-35
• 2.3 細(xì)胞培養(yǎng)上清酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測TGF-β135
• 2.4 實時定量PCR35-38
• 2.5 免疫印跡反應(yīng)（SDS-PAGE/Western blot）38-39
• 2.6 統(tǒng)計學(xué)處理39
• 3 結(jié)果39-43
• 3.1 穩(wěn)定轉(zhuǎn)染HBx蛋白肝細(xì)胞株L02-HBx的建立39-40
• 3.2 HBx通過旁分泌TGF-β1 上調(diào)HSC中CD147表達(dá)40-41
• 3.3 HSC中TGF-β1 上調(diào)CD147和肝纖維化相關(guān)分子的表達(dá)41-43
• 3.4 過表達(dá)CD147促進(jìn)HSC中肝纖維化相關(guān)分子的上調(diào)表達(dá)43
• 4 討論43-45
• 第二部分 HBV轉(zhuǎn)基因小鼠中CD147表達(dá)上調(diào)促進(jìn)肝纖維化45-58
• 1 材料45-47
• 1.1 實驗動物45
• 1.2 主要儀器45-46
• 1.3 主要試劑46-47
• 1.4 主要緩沖液47
• 2 方法47-50
• 2.1 免疫組織化學(xué)47-48
• 2.2 H&E染色48
• 2.3 組織免疫熒光染色48-49
• 2.4 天狼星紅染色49
• 2.5 Masson三色染色49
• 2.6 免疫印跡反應(yīng)（western blot）49
• 2.7 統(tǒng)計學(xué)處理49-50
• 3 結(jié)果50-55
• 3.1 HBV-tg小鼠表達(dá)HBx蛋白50
• 3.2 HBV-tg小鼠發(fā)生自發(fā)纖維化50-52
• 3.3 CD147分子和肝纖維化相關(guān)分子在HBV-tg小鼠肝臟組織表達(dá)上調(diào)52-54
• 3.4 在HBV-tg小鼠肝纖維化組織中CD147、TGF-β1、α-SMA共定位于HSC中54-55
• 4 討論55-58
• 第三部分 在HSC中TGF-Β1 通過SMADS信號途徑轉(zhuǎn)錄調(diào)控CD147的表達(dá)58-74
• 1 材料58-60
• 1.1 細(xì)胞系58
• 1.2 主要儀器設(shè)備58-59
• 1.3 主要試劑59-60
• 1.4 主要緩沖液60
• 2 方法60-65
• 2.1 細(xì)胞培養(yǎng)60-61
• 2.2 實驗動物61
• 2.3 細(xì)胞免疫熒光61
• 2.4 RNA干涉61-62
• 2.5 熒光素酶基因報告系統(tǒng)檢測Smad4對CD147的調(diào)控作用62
• 2.6 染色質(zhì)免疫共沉淀（Ch IP）62-64
• 2.7 Smad4結(jié)合序列定點突變后檢測雙熒光素酶系統(tǒng)64-65
• 2.8 免疫印跡反應(yīng)（Western blot）65
• 2.9 統(tǒng)計學(xué)處理65
• 3 結(jié)果65-71
• 3.1 Smad信號通路參與了TGF-β1 誘導(dǎo)的CD147表達(dá)65-67
• 3.2 下調(diào)Smad2、Smad3、Smad4抑制CD147的表達(dá)67-68
• 3.3 Smad4上調(diào)CD147的轉(zhuǎn)錄表達(dá)68-69
• 3.4 確定Smad4直接結(jié)合CD147啟動子的特定位點69-71
• 4 討論71-74
• 小結(jié)74-75
• 參考文獻(xiàn)75-88
• 附錄88-102
• 個人簡歷和研究成果102-103
• 致謝103

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本文編號：932603