本文關(guān)鍵詞：尋找小分子物質(zhì)穩(wěn)定角蛋白結(jié)構(gòu)保護肝損傷的研究

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【摘要】：背景慢性乙型肝炎、藥物性肝損害等其他多種因素可造成我國患者肝臟損傷,在肝損傷發(fā)生過程中患者個體之間差異較大,同種病因往往可導(dǎo)致完全不同的轉(zhuǎn)歸,因此其他潛在的造成這種個體差異的因素需要進一步探究。角蛋白是三大細胞骨架蛋白中間絲蛋白的最大亞群,它在肝細胞中與肝細胞結(jié)構(gòu)、功能密切相關(guān),特別是研究發(fā)現(xiàn)角蛋白基因突變可導(dǎo)致宿主容易造成肝臟損傷,因此它是否作為一種潛在因素影響著患者不同的轉(zhuǎn)歸,有待進一步研究。肝臟特異性角蛋白K18 R90C突變造成其結(jié)構(gòu)改變,使表達該類角蛋白的肝細胞變得脆弱且使宿主容易發(fā)生肝臟損傷。尋找能夠逆轉(zhuǎn)突變角蛋白結(jié)構(gòu)的方法,從而恢復(fù)其結(jié)構(gòu)功能,是保護及治療肝臟損傷的一種新方法。目的本研究希望能夠找到逆轉(zhuǎn)突變角蛋白結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì),穩(wěn)定其突變結(jié)構(gòu),恢復(fù)角蛋白功能并為肝臟損傷提供保護,并研究相關(guān)小分子物質(zhì)的保護機制,進一步闡述角蛋白結(jié)構(gòu)改變的原因。本研究為肝臟損傷提供了新的治療前景,同時也為以肝損傷為代表的“中間絲蛋白相關(guān)疾病”的治療提供了新的方向。并且本研究為將來進一步探究角蛋白是否與肝損傷個體差異有關(guān),以及我國患者中角蛋白突變情況的研究提供了依據(jù)。方法本研究將通過以免疫熒光圖像為基礎(chǔ)的小分子藥物篩選方法,尋找能夠穩(wěn)定突變角蛋白結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì),在突變細胞及轉(zhuǎn)基因小鼠中分別驗證該小分子的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定作用,并將之作為預(yù)防性藥物檢測其在突變細胞和小鼠中的肝損傷保護作用,并進一步通過免疫組化、免疫共沉淀以及重建實驗探究小分子物質(zhì)的作用機制。結(jié)果PKC412是一種多蛋白激酶抑制劑,本研究發(fā)現(xiàn)它能夠改變K18 R90C突變結(jié)構(gòu),在熒光顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)它能使突變結(jié)構(gòu)恢復(fù)到正常的細胞骨架蛋白結(jié)構(gòu)。并且PKC412能夠為突變細胞及轉(zhuǎn)基因小鼠提供保護,與未經(jīng)PKC412處理的細胞相比,其能夠減少細胞凋亡相關(guān)信號的表達,而與對照組小鼠相比,它能夠大大減少急性肝損傷的發(fā)生(PKC412處理小鼠平均血清ALT水平為266 U/L,而對照組小鼠平均ALT水平為6546 U/L,P0.05,且HE染色表明PKC412能夠減少小鼠急性肝損傷后肝臟出血)。本研究中還進一步探究了PKC412產(chǎn)生保護作用的機制,發(fā)現(xiàn)PKC412是通過改變非肌肉型肌球蛋白重鏈(NMHC)IIA的磷酸化程度,從而調(diào)節(jié)其與角蛋白之間的結(jié)合程度來改變突變角蛋白結(jié)構(gòu)的,而研究中的重建實驗進一步表明,PKC412作為蛋白激酶抑制劑對NMHC IIA的磷酸化改變而非對角蛋白的磷酸化改變是其發(fā)揮作用的關(guān)鍵。結(jié)論本文發(fā)現(xiàn)了多蛋白激酶抑制劑PKC412能夠逆轉(zhuǎn)突變角蛋白結(jié)構(gòu),并且能夠為突變細胞提供凋亡保護,同時也能減少帶有突變的轉(zhuǎn)基因小鼠的急性肝損傷。PKC412的保護作用與其促進K8/K18和NMHC IIA的結(jié)合相關(guān),并且受到NMHC IIA的磷酸化調(diào)節(jié)。
【關(guān)鍵詞】：角蛋白 肝損傷 非肌肉肌鈣蛋白IIA 磷酸化
【學(xué)位授予單位】：上海交通大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 中文部分6-50
• 中文摘要6-8
• 英文摘要8-11
• 英文縮略詞11-12
• 第一章 緒論12-17
• 1.1 課題依據(jù)12
• 1.2 中間絲蛋白相關(guān)疾病12-14
• 1.3 角蛋白及肝損傷14-16
• 1.4 研究目的16-17
• 第二章 材料與方法17-21
• 2.1 小分子藥物的篩選17
• 2.2 細胞凋亡的誘導(dǎo)及免疫組化17-18
• 2.3 動物實驗18
• 2.4 免疫熒光及H&E染色18-19
• 2.5 免疫組化標(biāo)本的制備和角蛋白的提取19
• 2.6 免疫沉淀和重建實驗19-20
• 2.7 逆轉(zhuǎn)錄PCR20
• 2.8 統(tǒng)計學(xué)方法20-21
• 第三章 結(jié)果21-35
• 3.1 篩選能夠穩(wěn)定突變角蛋白結(jié)構(gòu)的小分子物質(zhì)21
• 3.2 PKC412 能夠保護細胞減少凋亡發(fā)生及小鼠急性肝損傷21-24
• 3.3 PKC412 能夠使角蛋白與NMHC-IIA結(jié)合增強24-27
• 3.4 NMHC-IIA在PKC412 穩(wěn)定突變角蛋白結(jié)構(gòu)的作用中是必須的27-28
• 3.5 PKC412 能夠抑制NMHC-IIA磷酸化從而促進其與角蛋白的結(jié)合28-35
• 第四章 討論35-38
• 補充圖表38-39
• 補充表1 參考文獻39-46
• 參考文獻46-49
• 總結(jié)與展望49-50
• 英文部分50-64
• Abstract50-51
• 1. Introduction51
• 2. Materials and Methods51-55
• 2.1 Mouse experiments51-52
• 2.2 Immunofluorescence and hematoxylin-eosin staining52-53
• 2.3 High throughput screening and analysis53
• 2.4 Cultured cell apoptosis induction, and immunoblotting53-54
• 2.5 NMHC-IIA si RNA treatment54
• 2.6 Sample fractionation and keratin isolation54
• 2.7 Immunoprecipitation and reconstitution experiments54-55
• 2.8 Reverse Transcription-PCR55
• 3. Results55-58
• 3.1 Drug screening for compounds that normalize keratin filament disorganization55-56
• 3.2 PKC412 protects against apoptosis in cultured cells and in mouse liver56
• 3.3 A novel association between keratin and NMHC-IIA is enhanced by PKC412 treatment56-57
• 3.4 NMHC-II Aexpression is required for PKC412-mediated keratin filament normalization57
• 3.5 PKC412-mediated hypophosphorylation of NMHC-IIA enhances its association with K8/K1857-58
• 4. Discussion58-60
• References60-64
• 致謝64-66
• 學(xué)術(shù)論文和科研成果目錄66

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中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前10條

1 曾樂;肝損傷的保守治療[J];中國急救醫(yī)學(xué);2002年05期

2 岳蘭竹;付蓉;阮二寶;梁勇;劉鴻;瞿文;宋嘉;關(guān)晶;王曉明;王國錦;王化泉;邢莉民;吳玉紅;王s，

本文編號：922381