本文關(guān)鍵詞：乳桿菌熱致死菌體對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用研究

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【摘要】：腸道炎癥發(fā)病率逐年提高,有關(guān)其預(yù)防和治療方面的問題已成為國(guó)內(nèi)外重點(diǎn)研究課題,目前對(duì)于腸炎的治療,主要通過藥物進(jìn)行,但藥物治療存在副作用,將益生菌作為生物制劑調(diào)節(jié)腸道炎癥,更具有應(yīng)用價(jià)值。因此,研究實(shí)驗(yàn)篩選出的四株干酪乳桿菌M5-L、副干酪乳桿菌Q8-L及鼠李糖乳桿菌L.GG和J10-L的炎癥調(diào)節(jié)作用對(duì)其臨床治療應(yīng)用具有重要意義。本論文首先采用1μg/m L脂多糖(Lps)誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞,建立細(xì)胞炎癥模型。然后將四株菌的熱致死菌體作用于炎癥細(xì)胞模型。通過MTT法測(cè)定細(xì)胞存活率,研究發(fā)現(xiàn):熱致死菌體能夠增加細(xì)胞存活率,Lps存在時(shí)的細(xì)胞存活率為空白組的61%,加入M5-L、Q8-L、J10-L和L.GG菌株后,細(xì)胞存活率分別為預(yù)防組:68.9%,70.0%,66.3%,101.8%;共育組:82.12%,65.5%,61.4%,76.7%;治療組:95.9%,62.2%,64.73%,85.8%。以細(xì)胞存活為前提,研究了四種乳桿菌對(duì)炎性介質(zhì)(NO)、促炎(TNF-α,IL-6,IL-1β)和抗炎(IL-10)的調(diào)控作用。研究發(fā)現(xiàn):四株乳桿菌熱致死菌體均能顯著抑制NO,其中L.GG菌株效果最佳,NO含量由陽性對(duì)照組278.20 pg/m L降低為預(yù)防組122.99pg/m L,治療組248.28 pg/m L,共育組218.39 pg/m L。同時(shí)發(fā)現(xiàn),四株菌均能有效抑制TNF-α的表達(dá),其中Q8抑制效果最佳,TNF-α的表達(dá)量由陽性對(duì)照組58.95 pg/m L降低為預(yù)防組7.90 pg/m L,共育組(3.90 pg/m L),治療組(8.20pg/m L)。對(duì)IL-6和IL-1β的含量,各菌株作用效果不顯著,抗炎因子IL-10測(cè)定結(jié)果顯示預(yù)防組效果最佳,各菌株均增加至350.00 pg/m L以上。細(xì)胞周期測(cè)定結(jié)果顯示,加入Lps后,G0/G1期增加,產(chǎn)生阻滯,使細(xì)胞處于增殖活性較低的狀態(tài)。M5作用的預(yù)防組和治療組中G2/M+S%增加效果顯著,共育組中效果不顯著。Q8對(duì)治療組中的G2/M+S%增加顯著。J10與L.GG均能明顯增加G2/M+S%期,同時(shí)在預(yù)防組和共育組中,S期不同程度的減少。結(jié)果表明:乳桿菌能改變細(xì)胞周期,使細(xì)胞處于分裂旺盛階段。為進(jìn)一步測(cè)定四種乳桿菌對(duì)炎癥因子的調(diào)控作用,采用RT-PCR方法測(cè)定了上游調(diào)控因子iNOS、細(xì)胞因子TNF-α和IL-6的mRNA水平表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn):Lps能使細(xì)胞內(nèi)的iNOSmRNA水平顯著提高,Q8、J10菌對(duì)iNOS的m RNA水平具有顯著抑制作用,L.GG組效果更顯著,M菌的作用效果不顯著;四株菌株均能有效抑制TNF-α的mRNA水平表達(dá);M菌和J菌能夠顯著地降低IL-6的mRNA水平表達(dá),其中預(yù)防組和治療組作用效果顯著,經(jīng)L.GG菌作用的治療組不顯著,Q8菌促進(jìn)了IL-6的分泌。研究結(jié)果表明:四種熱致死菌體對(duì)相關(guān)炎癥因子的調(diào)控作用具有差異性。最后,通過western方法測(cè)定四種乳桿菌對(duì)信號(hào)通路中i NOS和NF-κBp65兩種蛋白表達(dá)變化的影響。研究發(fā)現(xiàn):M5對(duì)細(xì)胞炎癥具有治療作用且效果較顯著;Q8具有預(yù)防和緩解細(xì)胞炎癥作用;乳桿菌J10不能抑制i NOS的蛋白表達(dá);L.GG菌只對(duì)預(yù)防組具有抑制作用。NF-κB在Lps作用下被激活,促使下游產(chǎn)生多種細(xì)胞因子,加速細(xì)胞炎癥。M5不能抑制NF-κBp65的表達(dá),Q8的治療組、J10的預(yù)防組和L.GG作用的預(yù)防組和共育組治療效果顯著。其余實(shí)驗(yàn)組的NF-κBp65水平較高,沒有抑制趨勢(shì)。綜上,四種乳桿菌對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞炎癥反應(yīng)的調(diào)控作用存在菌株特異性和作用時(shí)間差異性。
【關(guān)鍵詞】：抗炎 乳桿菌 死菌體 巨噬細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：哈爾濱工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：TS201.3;R574
【目錄】：

• 摘要4-6
• Abstract6-10
• 第1章 緒論10-16
• 1.1 乳酸菌與腸道炎癥10
• 1.2 乳酸菌對(duì)腸道炎癥的主要調(diào)控途徑10-13
• 1.2.1 PPARγ 介導(dǎo)NF-κB途徑10-11
• 1.2.2 Toll受體介導(dǎo)的NF-κB/MAPKs途徑11-12
• 1.2.3 NOD2受體介導(dǎo)的NF-κB途徑12-13
• 1.3 巨噬細(xì)胞與腸道炎癥13-14
• 1.4 課題研究背景及目的意義14-15
• 1.5 技術(shù)路線15-16
• 第2章 材料和方法16-27
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料16-19
• 2.1.1 藥品與試劑16-17
• 2.1.2 實(shí)驗(yàn)儀器17-18
• 2.1.3 菌種和細(xì)胞18-19
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法19-26
• 2.2.1 菌株處理19
• 2.2.2 RAW264.7 細(xì)胞培養(yǎng)19
• 2.2.3 體外細(xì)胞炎癥模型的構(gòu)建19-20
• 2.2.4 MTT檢測(cè)巨噬細(xì)胞增殖活性20
• 2.2.5 細(xì)胞HE染色觀察細(xì)胞形態(tài)20-21
• 2.2.6 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)乳桿菌對(duì)細(xì)胞周期的影響21
• 2.2.7 NO試劑盒測(cè)定上清液中NO的含量21
• 2.2.8 ELISA法測(cè)定上清液中細(xì)胞因子的含量21-22
• 2.2.9 RT-PCR測(cè)定細(xì)胞因子m RNA水平的表達(dá)量22-25
• 2.2.10 Western Bloting檢測(cè)iNOS和NF-κBp65蛋白的表達(dá)25-26
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析26-27
• 第3章 乳桿菌熱致死菌體對(duì)RAW264.7 細(xì)胞因子及炎性介質(zhì)分泌的影響27-45
• 3.1 菌株計(jì)數(shù)結(jié)果28
• 3.2 乳桿菌熱致死菌體對(duì)細(xì)胞活性的影響28-29
• 3.3 乳桿菌熱致死菌體對(duì)細(xì)胞形態(tài)的影響29
• 3.4 乳桿菌熱致死菌體對(duì)巨噬細(xì)胞周期的影響29-31
• 3.5 炎性介質(zhì)NO含量測(cè)定結(jié)果31-34
• 3.6 細(xì)胞上清中促炎因子測(cè)定結(jié)果34-41
• 3.6.1 乳桿菌熱致死菌體對(duì)促炎因子TNF-α 的影響34-37
• 3.6.2 乳桿菌熱致死菌體對(duì)促炎因子IL-6 的影響37-39
• 3.6.3 乳桿菌熱致死菌體對(duì)促炎因子 IL-1β 的影響39-41
• 3.7 細(xì)胞上清中抗炎因子含量的測(cè)定結(jié)果41-43
• 3.8 本章小結(jié)43-45
• 第4章 乳桿菌熱致死菌體抗炎作用機(jī)制研究45-62
• 4.1 乳桿菌熱致死菌體對(duì)NF-κB信號(hào)通路的調(diào)控作用46-55
• 4.1.1 乳桿菌熱致死菌體對(duì)NF-κB相關(guān)細(xì)胞因子m RNA水平的調(diào)控46-52
• 4.1.2 乳桿菌熱致死菌體對(duì)NF-κBp65蛋白水平表達(dá)的影響52-55
• 4.2 乳桿菌熱致死菌體對(duì)i NOS-NO表達(dá)過程的調(diào)控作用55-60
• 4.2.1 乳桿菌對(duì)細(xì)胞中iNOSmRNA水平表達(dá)的影響55-57
• 4.2.2 乳桿菌熱致死菌體對(duì)i NOS蛋白含量的影響57-60
• 4.3 本章小結(jié)60-62
• 結(jié)論62-64
• 參考文獻(xiàn)64-71
• 攻讀碩士學(xué)位期間發(fā)表的學(xué)術(shù)論文71-73
• 致謝73

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本文編號(hào)：921770