本文關鍵詞：COFs對肝細胞線粒體損傷及能量代謝障礙機制的研究

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【摘要】：研究背景及目的烹調油煙(Cook oil fumes,COFs)是我國室內生活環(huán)境中最常見的空氣污染物之一,其成分復雜,嚴重威脅著居民(特別是女性)的健康。COFs中含有的大量脂溶性化合物,經呼吸道進入機體后,肝臟是其主要的代謝器官,在此過程中可能會產生肝毒性物質導致肝細胞損傷。氧化損傷是COFs最主要的毒作用,體內體外研究均已證實COFs可導致細胞內SOD活性降低、MDA的含量增加、ROS的堆積甚至抑制細胞ATP酶的活性。肝臟作為機體最重要的解毒器官,雖然已有動物實驗已經證實,COFs可導致肝臟發(fā)生炎癥、充血、水腫,微量元素代謝紊亂等病理性改變,但COFs致肝毒性的作用機制并不清楚,而線粒體作為細胞發(fā)生氧化損傷的靶,COFs能否誘導其功能損傷更是鮮見報道。本研究除了闡明COFs誘導肝細胞線粒體功能損傷外,還對其誘導肝細胞能量代謝障礙機制進行了探討。線粒體是細胞能量合成的主要場所,能量代謝障礙是線粒體功能損傷后的另一種細胞毒性結局,與氧化損傷后ROS的大量堆積相關,因此從分子水平上探索COFs誘導肝細胞氧化損傷及能量代謝障礙,有利于深入了解COFs對肝細胞的毒作用機制,從而為相關的生物學監(jiān)測、病因探索與預防提供科學依據(jù)。研究方法1.COFs對肝細胞的毒作用及線粒體功能的損傷首先用不同濃度COFs分別處理體外培養(yǎng)的HL7702人正常肝細胞24h,MTT法檢測不同濃度COFs對肝細胞存活率的影響,SPSS曲線擬合求出COFs對細胞的半數(shù)致死濃度,并確定染毒劑量。COFs染毒細胞24h后,激光共聚焦顯微鏡檢測細胞內ROS的水平,高效液相色譜法檢測細胞內腺苷酸(ATP\ADP\AMP)含量;肝細胞線粒體酶活性、線粒體膜通透性轉運孔(MPTP)的開放度、線粒體跨膜電位(ψm)及線粒體呼吸鏈復合體(I~V)活性分別采用酶標儀、熒光分光光度計、激光共聚焦顯微鏡及紫外分光光度計法測定。2.COFs對肝細胞能量代謝障礙機制的影響COFs處理肝細胞24h后,熒光定量PCR法檢測線粒體DNA編碼的能量代謝相關基因COX I-III、ATPase6和ATPase8的表達水平,以及核DNA編碼的能量代謝相關基因miR18lc的表達水平,并采用Spearman相關分析各指標間的相關性。研究結果1.cofs對肝細胞的毒作用及線粒體功能的損傷1.1cofs對肝細胞的毒作用①cofs染毒肝細胞24h后,可引起肝細胞存活率顯著降低(f=365.568,p0.05),cofs染毒濃度與細胞生存率之間關系符合對數(shù)模型(r=0.929),對hl7702細胞的半數(shù)抑制濃度為318.10μg/ml,95%可信區(qū)間為277.31~366.87μg/ml。確定染毒劑量組為20,40,80,160μg/ml及dmso溶劑對照組。②cofs染毒肝細胞24h后,40~160μg/mlcofs組肝細胞內ros含量增高,與對照組相比差異有統(tǒng)計學意義(f=241.95,p0.01),cofs染毒濃度與ros水平之間存在正的線性相關關性(r=0.978,p0.01)。③與對照組相比,cofs處理組肝細胞內atp、adp、amp及tan的含量均呈明顯下降趨勢(f=60.16,p0.01;f=281.05,p0.01;f=86.90,p0.01;f=130.37,p0.01);在dmso~40μg/ml范圍內,三組的atp/adp比值隨著染毒劑量的升高而升高(f=234.21,p0.01);除80μg/ml組ec值較高外,其余各劑量組間ec值無明顯變化。1.2cofs對肝細胞線粒體功能的損傷作用①cofs處理肝細胞24h后,對線粒體酶活性存在顯著抑制性(f=587.185,p0.05),與對照組相比,則有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs組對線粒體酶活性的相對抑制率分別為47.26%、90.30%、91.40%、95.83%。②隨著cofs濃度的升高,mptp孔相對開放度越高(f=195.3,p0.05),以dmso組為參照,則有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs組mptp孔相對開放度(%)分別為23.43%、33.22%、45.44%、56.64%。③在40~160μg/mlcofs濃度范圍內,可促使ψm下降(f=43.796,p0.05)。④20~160μg/mlcofs對線粒體呼吸鏈復合體Ⅰ-Ⅴ的活性有不同程度的抑制作用(f=91.673,p0.01;f=434.581,p0.01;f=11.904,p=0.01;f=111.063,p0.01;f=79.111,p0.01)。2.cofs對肝細胞能量代謝障礙機制的影響①cofs染毒24h后,可使呼吸鏈復合體Ⅴ亞基atpase6及atpase8mrna總體呈上升趨勢(f=130.297,p0.05;f=14.451,p0.05);呼吸鏈復合體Ⅳ亞基coxⅠ~Ⅲmrna總體呈上升趨勢,(f=161.518,p0.05;f=8.282,p0.05;f=46.648,p0.05);ndna編碼的mirna181mrna表達總體呈上升趨勢(f=6.31,p0.05)。研究結論1.COFs可抑制HL7702肝細胞的活性,其半數(shù)抑制濃度為318.10μg/ml,95%可信區(qū)間為277.31~366.87μg/ml;COFs可使肝細胞內ROS堆積、腺苷酸合成受阻。2.COFs誘導線粒體酶活性降低、MPTP孔開放、ψm崩解及MRCCⅠ~Ⅴ活性降低等功能性損傷,COFs所致線粒體功能損傷與ROS堆積及腺苷酸合成受阻相關。3.COFs可通過上調ATPase6和ATPase8 mRNA的表達抑制MRCCⅤ活性干擾ATP合成,導致細胞能量代謝障礙,即COFs可通過ATPase6/ATPase8-MRCCⅤ-ATP通路誘導能量代謝障礙;及上調線粒體DNA編碼的呼吸鏈復合體Ⅳ~Ⅴ亞基基因表達;COFs可使核DNA編碼的miRNA181過表達,調控MRCCⅣ活性及其線粒體DNA COXⅠ~Ⅲ基因的表達上調,來影響細胞內ATP水平,即COFs可通過miRNA181-COXⅠ~Ⅲ-MRCCⅣ-ATP通路影響ATP合成,導致能量代謝障礙。4.mtDNA基因表達水平改變,可使MRCCI~V活性下降,誘導ROS升高的因素,而高濃度的ROS又可以反過來攻擊mtDNA的表達,引起細胞氧化損傷及能量代謝障礙,即能量代謝相關基因表達水平改變,導致線粒體呼吸鏈復合體活性下降,可能是COFs誘導肝細胞線粒體能量代謝障礙和氧化損傷的原因之一。
【關鍵詞】：烹調油煙 肝細胞 線粒體 能量代謝 基因表達
【學位授予單位】：福建醫(yī)科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 英漢縮略詞表(按字母順序排列)4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 技術路線圖16-17
• 第一部分 烹調油煙對肝細胞及線粒體功能的影響17-48
• 1 材料17-20
• 2 實驗方法20-29
• 3 實驗結果29-42
• 4 討論42-48
• 第二部分 COFs誘導的能量代謝障礙相關機制的研究48-66
• 1 材料49-50
• 2 實驗方法50-55
• 3 實驗結果55-63
• 4 討論63-66
• 結論66-67
• 參考文獻67-72
• 綜述72-81
• 參考文獻78-81
• 致謝81-82
• 攻讀學位期間的成績82

【參考文獻】

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本文編號：917132