本文關(guān)鍵詞：COFs對肝細(xì)胞線粒體損傷及能量代謝障礙機(jī)制的研究

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【摘要】：研究背景及目的烹調(diào)油煙(Cook oil fumes,COFs)是我國室內(nèi)生活環(huán)境中最常見的空氣污染物之一,其成分復(fù)雜,嚴(yán)重威脅著居民(特別是女性)的健康。COFs中含有的大量脂溶性化合物,經(jīng)呼吸道進(jìn)入機(jī)體后,肝臟是其主要的代謝器官,在此過程中可能會產(chǎn)生肝毒性物質(zhì)導(dǎo)致肝細(xì)胞損傷。氧化損傷是COFs最主要的毒作用,體內(nèi)體外研究均已證實(shí)COFs可導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)SOD活性降低、MDA的含量增加、ROS的堆積甚至抑制細(xì)胞ATP酶的活性。肝臟作為機(jī)體最重要的解毒器官,雖然已有動物實(shí)驗已經(jīng)證實(shí),COFs可導(dǎo)致肝臟發(fā)生炎癥、充血、水腫,微量元素代謝紊亂等病理性改變,但COFs致肝毒性的作用機(jī)制并不清楚,而線粒體作為細(xì)胞發(fā)生氧化損傷的靶,COFs能否誘導(dǎo)其功能損傷更是鮮見報道。本研究除了闡明COFs誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體功能損傷外,還對其誘導(dǎo)肝細(xì)胞能量代謝障礙機(jī)制進(jìn)行了探討。線粒體是細(xì)胞能量合成的主要場所,能量代謝障礙是線粒體功能損傷后的另一種細(xì)胞毒性結(jié)局,與氧化損傷后ROS的大量堆積相關(guān),因此從分子水平上探索COFs誘導(dǎo)肝細(xì)胞氧化損傷及能量代謝障礙,有利于深入了解COFs對肝細(xì)胞的毒作用機(jī)制,從而為相關(guān)的生物學(xué)監(jiān)測、病因探索與預(yù)防提供科學(xué)依據(jù)。研究方法1.COFs對肝細(xì)胞的毒作用及線粒體功能的損傷首先用不同濃度COFs分別處理體外培養(yǎng)的HL7702人正常肝細(xì)胞24h,MTT法檢測不同濃度COFs對肝細(xì)胞存活率的影響,SPSS曲線擬合求出COFs對細(xì)胞的半數(shù)致死濃度,并確定染毒劑量。COFs染毒細(xì)胞24h后,激光共聚焦顯微鏡檢測細(xì)胞內(nèi)ROS的水平,高效液相色譜法檢測細(xì)胞內(nèi)腺苷酸(ATP\ADP\AMP)含量;肝細(xì)胞線粒體酶活性、線粒體膜通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔(MPTP)的開放度、線粒體跨膜電位(ψm)及線粒體呼吸鏈復(fù)合體(I~V)活性分別采用酶標(biāo)儀、熒光分光光度計、激光共聚焦顯微鏡及紫外分光光度計法測定。2.COFs對肝細(xì)胞能量代謝障礙機(jī)制的影響COFs處理肝細(xì)胞24h后,熒光定量PCR法檢測線粒體DNA編碼的能量代謝相關(guān)基因COX I-III、ATPase6和ATPase8的表達(dá)水平,以及核DNA編碼的能量代謝相關(guān)基因miR18lc的表達(dá)水平,并采用Spearman相關(guān)分析各指標(biāo)間的相關(guān)性。研究結(jié)果1.cofs對肝細(xì)胞的毒作用及線粒體功能的損傷1.1cofs對肝細(xì)胞的毒作用①cofs染毒肝細(xì)胞24h后,可引起肝細(xì)胞存活率顯著降低(f=365.568,p0.05),cofs染毒濃度與細(xì)胞生存率之間關(guān)系符合對數(shù)模型(r=0.929),對hl7702細(xì)胞的半數(shù)抑制濃度為318.10μg/ml,95%可信區(qū)間為277.31~366.87μg/ml。確定染毒劑量組為20,40,80,160μg/ml及dmso溶劑對照組。②cofs染毒肝細(xì)胞24h后,40~160μg/mlcofs組肝細(xì)胞內(nèi)ros含量增高,與對照組相比差異有統(tǒng)計學(xué)意義(f=241.95,p0.01),cofs染毒濃度與ros水平之間存在正的線性相關(guān)關(guān)性(r=0.978,p0.01)。③與對照組相比,cofs處理組肝細(xì)胞內(nèi)atp、adp、amp及tan的含量均呈明顯下降趨勢(f=60.16,p0.01;f=281.05,p0.01;f=86.90,p0.01;f=130.37,p0.01);在dmso~40μg/ml范圍內(nèi),三組的atp/adp比值隨著染毒劑量的升高而升高(f=234.21,p0.01);除80μg/ml組ec值較高外,其余各劑量組間ec值無明顯變化。1.2cofs對肝細(xì)胞線粒體功能的損傷作用①cofs處理肝細(xì)胞24h后,對線粒體酶活性存在顯著抑制性(f=587.185,p0.05),與對照組相比,則有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs組對線粒體酶活性的相對抑制率分別為47.26%、90.30%、91.40%、95.83%。②隨著cofs濃度的升高,mptp孔相對開放度越高(f=195.3,p0.05),以dmso組為參照,則有20μg/ml、40μg/ml、80μg/ml和160μg/mlcofs組mptp孔相對開放度(%)分別為23.43%、33.22%、45.44%、56.64%。③在40~160μg/mlcofs濃度范圍內(nèi),可促使ψm下降(f=43.796,p0.05)。④20~160μg/mlcofs對線粒體呼吸鏈復(fù)合體Ⅰ-Ⅴ的活性有不同程度的抑制作用(f=91.673,p0.01;f=434.581,p0.01;f=11.904,p=0.01;f=111.063,p0.01;f=79.111,p0.01)。2.cofs對肝細(xì)胞能量代謝障礙機(jī)制的影響①cofs染毒24h后,可使呼吸鏈復(fù)合體Ⅴ亞基atpase6及atpase8mrna總體呈上升趨勢(f=130.297,p0.05;f=14.451,p0.05);呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ亞基coxⅠ~Ⅲmrna總體呈上升趨勢,(f=161.518,p0.05;f=8.282,p0.05;f=46.648,p0.05);ndna編碼的mirna181mrna表達(dá)總體呈上升趨勢(f=6.31,p0.05)。研究結(jié)論1.COFs可抑制HL7702肝細(xì)胞的活性,其半數(shù)抑制濃度為318.10μg/ml,95%可信區(qū)間為277.31~366.87μg/ml;COFs可使肝細(xì)胞內(nèi)ROS堆積、腺苷酸合成受阻。2.COFs誘導(dǎo)線粒體酶活性降低、MPTP孔開放、ψm崩解及MRCCⅠ~Ⅴ活性降低等功能性損傷,COFs所致線粒體功能損傷與ROS堆積及腺苷酸合成受阻相關(guān)。3.COFs可通過上調(diào)ATPase6和ATPase8 mRNA的表達(dá)抑制MRCCⅤ活性干擾ATP合成,導(dǎo)致細(xì)胞能量代謝障礙,即COFs可通過ATPase6/ATPase8-MRCCⅤ-ATP通路誘導(dǎo)能量代謝障礙;及上調(diào)線粒體DNA編碼的呼吸鏈復(fù)合體Ⅳ~Ⅴ亞基基因表達(dá);COFs可使核DNA編碼的miRNA181過表達(dá),調(diào)控MRCCⅣ活性及其線粒體DNA COXⅠ~Ⅲ基因的表達(dá)上調(diào),來影響細(xì)胞內(nèi)ATP水平,即COFs可通過miRNA181-COXⅠ~Ⅲ-MRCCⅣ-ATP通路影響ATP合成,導(dǎo)致能量代謝障礙。4.mtDNA基因表達(dá)水平改變,可使MRCCI~V活性下降,誘導(dǎo)ROS升高的因素,而高濃度的ROS又可以反過來攻擊mtDNA的表達(dá),引起細(xì)胞氧化損傷及能量代謝障礙,即能量代謝相關(guān)基因表達(dá)水平改變,導(dǎo)致線粒體呼吸鏈復(fù)合體活性下降,可能是COFs誘導(dǎo)肝細(xì)胞線粒體能量代謝障礙和氧化損傷的原因之一。
【關(guān)鍵詞】：烹調(diào)油煙 肝細(xì)胞 線粒體 能量代謝 基因表達(dá)
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575
【目錄】：

• 英漢縮略詞表(按字母順序排列)4-6
• 中文摘要6-9
• Abstract9-13
• 前言13-16
• 技術(shù)路線圖16-17
• 第一部分 烹調(diào)油煙對肝細(xì)胞及線粒體功能的影響17-48
• 1 材料17-20
• 2 實(shí)驗方法20-29
• 3 實(shí)驗結(jié)果29-42
• 4 討論42-48
• 第二部分 COFs誘導(dǎo)的能量代謝障礙相關(guān)機(jī)制的研究48-66
• 1 材料49-50
• 2 實(shí)驗方法50-55
• 3 實(shí)驗結(jié)果55-63
• 4 討論63-66
• 結(jié)論66-67
• 參考文獻(xiàn)67-72
• 綜述72-81
• 參考文獻(xiàn)78-81
• 致謝81-82
• 攻讀學(xué)位期間的成績82

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：917132