本文關鍵詞：炎性Treg細胞在小鼠膽道閉鎖膽管炎癥中的作用及機制的研究

  更多相關文章： 小鼠BA模型 Treg細胞 IL-17+Foxp3+Treg細胞 表觀遺傳學

【摘要】：研究背景和目的： 自身免疫反應所致膽管進行性炎性損傷是膽道閉鎖(BA)重要發(fā)病機制。前期研究發(fā)現(xiàn)BA患兒匯管區(qū)有大量Foxp3+Treg浸潤,其具有異質性,包含有致炎效應的IL-17+Foxp3+Treg亞群。文獻報道,表觀遺傳學修飾是調控Foxp3表達的重要機制。我們推測BA匯管區(qū)細胞因子(TGF-β、IL-6等)消長可通過表觀遺傳學機制調控T細胞FoxP3基因表達,誘導IL-17+FoxP3+Treg分化并分泌IL-17A,從而介導膽管損傷。鑒此,本項目擬開展如下研究：①動態(tài)觀察BA小鼠模型肝臟微環(huán)境細胞因子(TGF-β、IL-6等)表達特點、Treg細胞Foxp3基因啟動子DNA甲基化狀態(tài),以及對Foxp3基因表達、Treg細胞亞群分化的影響；②用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deo-xycytidine, Aza)修飾Foxp3基因,觀察肝臟炎癥環(huán)境中不同Treg細胞亞群功能狀態(tài)及其與膽管損傷相關性。明確BA小鼠模型中IL-17+Foxp3+Treg形成以及參與膽管損傷機制。 研究方法： 第一部分：SPF級Balb/c小鼠隨機分為正常對照組和BA組,BA組小鼠出生后12小時內腹腔注射恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖模型。于出生小鼠第4天、第7天、第10天處死(BA組和對照組)并摘取肝臟。動態(tài)檢測小鼠肝臟組織中炎性細胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性細胞因子(IL-10、TGF-β的變化；IL-17+FoxP3+Treg細胞、IL-17-Foxp3+Treg細胞的分布特點、細胞絕對數(shù)和占CD4+T細胞的比例；以及Foxp3基因啟動子CpG島甲基化變化水平。 第二部分：SPF級Balb/c小鼠隨機分為正常對照組、BA組和Aza干預組,BA組小鼠出生后12小時內腹腔注射恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖模型,Aza干預組在新生鼠RRV建模后連續(xù)4天腹腔注射甲基轉移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, Aza),分別觀察三組小鼠出生第4天、第7天、第10天觀察肝臟組織中炎性細胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性細胞因子(IL-10、 TGF-β)的變化,Foxp3基因啟動子CpG島甲基化水平,IL-17+FoxP3+Treg細胞、IL-17-Foxp3+Treg細胞和Th17細胞的比例,以及對膽管炎癥損傷和小鼠生存率的影響。 實驗結果： 第一部分：BA組所檢測各細胞因子在第4天表達量逐漸上升,在第7天達到峰值,與對照組相比,IL-6表達量升高31倍、IL-10提高了6倍、INF-γ提高了11倍,TGF-β提高了3.2倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；IL-17、IL-23第4天含量逐漸上升,第10天達到峰值,與對照組相比,IL-17為6倍,IL-23為4倍,差異具有統(tǒng)計學意義(P值分別為P0.001,P0.01,P0.05,P0.05)。流式細胞儀檢測BA組小鼠肝臟淋巴細胞中IL-17-Foxp3+Treg、IL-17+Foxp3+Treg/CD4+細胞比例及絕對數(shù),從第4天開始升高,第7天達到峰值,隨后逐漸下降,各時間點均較對照組升高(P值均小于0.05)；免疫熒光組織化學顯示第7天BA組小鼠肝臟匯管區(qū)存在大量IL-17-Foxp3+Treg、 IL-17+Foxp3+Treg細胞(P0.05)。流式細胞儀檢測BA組小鼠肝臟淋巴細胞中IL-17+ToxP3+Treg/CD4+細胞比例從第4天開始升高,第7天達到峰值,隨后逐漸下降,各時間點均較正常對照組明顯升高(P0.05)；從細胞絕對值來看,第7天、第10天BA小鼠IL-17+Foxp3+Treg細胞、IL-17-Foxp3+Treg細胞數(shù)量明顯高于正常對照組(P0.05)。亞硫酸氫鹽測序法(BSP)顯示BA組第4天、第7天、第10天肝臟組織中FoxP3+Treg細胞中Foxp3基因啟動子CpG島甲基化程度逐漸增高(第10天略有下降)且均高于正常對照組(P0.05)。 第二部分：Aza干預組小鼠肝臟中細胞因子IL-6、INF-γ、IL-17、IL-23在第4天、第7天、第10天較BA組小鼠中的表達下降明顯,且具有統(tǒng)計學意義(P0.05)；Aza組細胞因子IL-10和TGF-β含量在第7天較BA組升高(P0.05),并持續(xù)升高第10天。流式細胞術檢測顯示,第7天Aza干預組IL-17+FoxP3+Treg細胞比例和Th17占CD4+比例較BA組開始出現(xiàn)下降(P0.05)；第7天、第10天Aza組IL-17+FoxP3+Treg細胞、Th17細胞的絕對數(shù)值低于BA組(P值均小于0.05)。BSP顯示Aza干預組第4天、第7天、第10天Foxp3+Treg細胞中Foxp3基因啟動子CpG島甲基化均低于對照組(P0.05)。HE組織病理學染色顯示,第4天、第7天、第10天Aza干預組肝臟匯管區(qū)組織炎性病理損傷較BA組均減輕。Aza干預組小鼠的生存率較BA組回升(P0.05)。 實驗結論： 1、RRV誘導的小鼠膽道閉鎖模型中,肝內膽管微環(huán)境中炎性細胞因子和IL-17+Foxp3+Treg細胞發(fā)生著先升高后逐漸下降的變化。其中INF-γ、IL-6、IL-10、TGF-β細胞因子早于IL-17、IL-23細胞因子達到峰值。而Foxp3基因持續(xù)保持高DNA甲基化水平。 2、微環(huán)境中IL-6可上調Foxp3基因啟動子DNA甲基化,IL-6和TGF-β共同作用可能是促進IL-17+FoxP3+Treg細胞分化形成炎性Treg細胞并參與BA膽管損傷的重要原因。 3、DNA甲基化抑制劑(Aza)可下調Foxp3基因甲基化水平,減少IL-17+Foxp3+Treg細胞產生,抑制炎性因子(IL-17A)的產生,從而減輕BA膽管損傷。
【關鍵詞】：小鼠BA模型 Treg細胞 IL-17+Foxp3+Treg細胞 表觀遺傳學
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.7
【目錄】：

• 前言9-16
• 參考文獻12-16
• 摘要16-19
• Abstract19-23
• 英文縮略詞表23-26
• 第一部分 炎性T細胞在膽道閉鎖小鼠中的表達及機制研究26-62
• 材料29-36
• 一、RRV病毒培養(yǎng)和病毒滴度測定29
• 二、Balb/c小鼠建立膽道閉鎖模型29-30
• 三、實驗試劑30-32
• 四、試劑盒32
• 五、抗體32-33
• 六、實驗材料33-34
• 七、儀器設備34-35
• 八、細胞和病毒35-36
• 方法36-45
• 一、小鼠肝臟中炎性調節(jié)性T細胞的表達及分布36-37
• 二、肝臟內細胞因子的檢測37-38
• 三、小鼠肝臟中調節(jié)性T細胞的分離和檢測方法38
• 四、流式細胞術檢測IL-17Foxp3~+Treg細胞38-39
• 五、小鼠肝臟內炎性Foxp3基因的表觀遺傳學的檢測39-44
• 六、統(tǒng)計學處理44-45
• 結果45-57
• 一、膽道閉鎖發(fā)生率及癥狀表現(xiàn)45-48
• 二、肝臟內細胞因子的檢測48-50
• 三、調節(jié)性T細胞亞群在小鼠肝臟中分布50-51
• 四、調節(jié)性T細胞亞群在小鼠肝臟CD4+細胞中的比例51-53
• 五、IL-17~+Foxp3~+細胞和IL-17~-Foxp3~+細胞中CD25的表達53
• 六、IL-17~+Foxp3~+細胞和IL-17~-Foxp3~+細胞CD4~+T細胞中的比例53-55
• 七、小鼠肝臟內Foxp3~+Treg細胞甲基化的檢測55-57
• 討論57-60
• 參考文獻60-62
• 第二部分 Foxp3基因甲基化調控在小鼠膽道閉鎖肝臟炎性調節(jié)性T細胞及調節(jié)性T細胞的作用影響62-102
• 材料65-72
• 一、Balb/c小鼠建立膽道閉鎖模型65
• 二、實驗試劑65-67
• 三、試劑盒67-68
• 四、抗體68
• 五、實驗材料68-69
• 六、儀器設備69-71
• 七、細胞和病毒71-72
• 方法72-84
• 一、小鼠肝臟中炎性調節(jié)性T細胞的表達及分布72-73
• 二、Aza干預后小鼠肝臟內細胞因子的檢測73-74
• 三、實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測Foxp3、ROR-γ t和IL-17mRNA及其相關蛋白的表達74-78
• 四、Aza干預后小鼠肝臟中炎性調節(jié)性T細胞的分離和檢測78
• 五、Aza干預后小鼠肝臟內炎性T細胞表觀遺傳學的檢測78-83
• 六、統(tǒng)計學處理83-84
• 結果84-96
• 一、Aza干預后炎性調節(jié)性T細胞亞群在小鼠肝臟CD4~+細胞中的比例84-87
• 二、Aza干預后調節(jié)性T細胞亞群在小鼠肝臟中的分布87-89
• 三、Aza干預后肝臟內細胞因子的檢測89-90
• 四、Aza干預后檢測膽道閉鎖小鼠Foxp3,IL-17A以及ROR-γ t基因和蛋白表達的變化90-92
• 五、Aza干預后炎性調節(jié)性T細胞亞群在小鼠肝臟CD4~+細胞中的比例92-93
• 六、Aza干預后小鼠肝臟內Foxp3~+Treg細胞甲基化的檢測93-96
• 討論96-99
• 參考文獻99-102
• 結論102-103
• 綜述103-116
• 參考文獻111-116
• 致謝116-118
• 附錄 在校攻讀學位期間發(fā)表論文118

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