本文關(guān)鍵詞：炎性Treg細(xì)胞在小鼠膽道閉鎖膽管炎癥中的作用及機(jī)制的研究

  更多相關(guān)文章： 小鼠BA模型 Treg細(xì)胞 IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞 表觀遺傳學(xué)

【摘要】：研究背景和目的： 自身免疫反應(yīng)所致膽管進(jìn)行性炎性損傷是膽道閉鎖(BA)重要發(fā)病機(jī)制。前期研究發(fā)現(xiàn)BA患兒匯管區(qū)有大量Foxp3+Treg浸潤(rùn),其具有異質(zhì)性,包含有致炎效應(yīng)的IL-17+Foxp3+Treg亞群。文獻(xiàn)報(bào)道,表觀遺傳學(xué)修飾是調(diào)控Foxp3表達(dá)的重要機(jī)制。我們推測(cè)BA匯管區(qū)細(xì)胞因子(TGF-β、IL-6等)消長(zhǎng)可通過(guò)表觀遺傳學(xué)機(jī)制調(diào)控T細(xì)胞FoxP3基因表達(dá),誘導(dǎo)IL-17+FoxP3+Treg分化并分泌IL-17A,從而介導(dǎo)膽管損傷。鑒此,本項(xiàng)目擬開(kāi)展如下研究：①動(dòng)態(tài)觀察BA小鼠模型肝臟微環(huán)境細(xì)胞因子(TGF-β、IL-6等)表達(dá)特點(diǎn)、Treg細(xì)胞Foxp3基因啟動(dòng)子DNA甲基化狀態(tài),以及對(duì)Foxp3基因表達(dá)、Treg細(xì)胞亞群分化的影響；②用DNA甲基化抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deo-xycytidine, Aza)修飾Foxp3基因,觀察肝臟炎癥環(huán)境中不同Treg細(xì)胞亞群功能狀態(tài)及其與膽管損傷相關(guān)性。明確BA小鼠模型中IL-17+Foxp3+Treg形成以及參與膽管損傷機(jī)制。 研究方法： 第一部分：SPF級(jí)Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組和BA組,BA組小鼠出生后12小時(shí)內(nèi)腹腔注射恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖模型。于出生小鼠第4天、第7天、第10天處死(BA組和對(duì)照組)并摘取肝臟。動(dòng)態(tài)檢測(cè)小鼠肝臟組織中炎性細(xì)胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性細(xì)胞因子(IL-10、TGF-β的變化；IL-17+FoxP3+Treg細(xì)胞、IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞的分布特點(diǎn)、細(xì)胞絕對(duì)數(shù)和占CD4+T細(xì)胞的比例；以及Foxp3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化變化水平。 第二部分：SPF級(jí)Balb/c小鼠隨機(jī)分為正常對(duì)照組、BA組和Aza干預(yù)組,BA組小鼠出生后12小時(shí)內(nèi)腹腔注射恒河猴輪狀病毒(RRV)建立膽道閉鎖模型,Aza干預(yù)組在新生鼠RRV建模后連續(xù)4天腹腔注射甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-氮雜-2'-脫氧胞苷(5-aza-2'-deoxycytidine, Aza),分別觀察三組小鼠出生第4天、第7天、第10天觀察肝臟組織中炎性細(xì)胞因子(INF-γ、IL-6、IL-17A、IL-23)和抑炎性細(xì)胞因子(IL-10、 TGF-β)的變化,Foxp3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化水平,IL-17+FoxP3+Treg細(xì)胞、IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞和Th17細(xì)胞的比例,以及對(duì)膽管炎癥損傷和小鼠生存率的影響。 實(shí)驗(yàn)結(jié)果： 第一部分：BA組所檢測(cè)各細(xì)胞因子在第4天表達(dá)量逐漸上升,在第7天達(dá)到峰值,與對(duì)照組相比,IL-6表達(dá)量升高31倍、IL-10提高了6倍、INF-γ提高了11倍,TGF-β提高了3.2倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；IL-17、IL-23第4天含量逐漸上升,第10天達(dá)到峰值,與對(duì)照組相比,IL-17為6倍,IL-23為4倍,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P值分別為P0.001,P0.01,P0.05,P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)BA組小鼠肝臟淋巴細(xì)胞中IL-17-Foxp3+Treg、IL-17+Foxp3+Treg/CD4+細(xì)胞比例及絕對(duì)數(shù),從第4天開(kāi)始升高,第7天達(dá)到峰值,隨后逐漸下降,各時(shí)間點(diǎn)均較對(duì)照組升高(P值均小于0.05)；免疫熒光組織化學(xué)顯示第7天BA組小鼠肝臟匯管區(qū)存在大量IL-17-Foxp3+Treg、 IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞(P0.05)。流式細(xì)胞儀檢測(cè)BA組小鼠肝臟淋巴細(xì)胞中IL-17+ToxP3+Treg/CD4+細(xì)胞比例從第4天開(kāi)始升高,第7天達(dá)到峰值,隨后逐漸下降,各時(shí)間點(diǎn)均較正常對(duì)照組明顯升高(P0.05)；從細(xì)胞絕對(duì)值來(lái)看,第7天、第10天BA小鼠IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞、IL-17-Foxp3+Treg細(xì)胞數(shù)量明顯高于正常對(duì)照組(P0.05)。亞硫酸氫鹽測(cè)序法(BSP)顯示BA組第4天、第7天、第10天肝臟組織中FoxP3+Treg細(xì)胞中Foxp3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化程度逐漸增高(第10天略有下降)且均高于正常對(duì)照組(P0.05)。 第二部分：Aza干預(yù)組小鼠肝臟中細(xì)胞因子IL-6、INF-γ、IL-17、IL-23在第4天、第7天、第10天較BA組小鼠中的表達(dá)下降明顯,且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；Aza組細(xì)胞因子IL-10和TGF-β含量在第7天較BA組升高(P0.05),并持續(xù)升高第10天。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)顯示,第7天Aza干預(yù)組IL-17+FoxP3+Treg細(xì)胞比例和Th17占CD4+比例較BA組開(kāi)始出現(xiàn)下降(P0.05)；第7天、第10天Aza組IL-17+FoxP3+Treg細(xì)胞、Th17細(xì)胞的絕對(duì)數(shù)值低于BA組(P值均小于0.05)。BSP顯示Aza干預(yù)組第4天、第7天、第10天Foxp3+Treg細(xì)胞中Foxp3基因啟動(dòng)子CpG島甲基化均低于對(duì)照組(P0.05)。HE組織病理學(xué)染色顯示,第4天、第7天、第10天Aza干預(yù)組肝臟匯管區(qū)組織炎性病理?yè)p傷較BA組均減輕。Aza干預(yù)組小鼠的生存率較BA組回升(P0.05)。 實(shí)驗(yàn)結(jié)論： 1、RRV誘導(dǎo)的小鼠膽道閉鎖模型中,肝內(nèi)膽管微環(huán)境中炎性細(xì)胞因子和IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞發(fā)生著先升高后逐漸下降的變化。其中INF-γ、IL-6、IL-10、TGF-β細(xì)胞因子早于IL-17、IL-23細(xì)胞因子達(dá)到峰值。而Foxp3基因持續(xù)保持高DNA甲基化水平。 2、微環(huán)境中IL-6可上調(diào)Foxp3基因啟動(dòng)子DNA甲基化,IL-6和TGF-β共同作用可能是促進(jìn)IL-17+FoxP3+Treg細(xì)胞分化形成炎性Treg細(xì)胞并參與BA膽管損傷的重要原因。 3、DNA甲基化抑制劑(Aza)可下調(diào)Foxp3基因甲基化水平,減少IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞產(chǎn)生,抑制炎性因子(IL-17A)的產(chǎn)生,從而減輕BA膽管損傷。
【關(guān)鍵詞】：小鼠BA模型 Treg細(xì)胞 IL-17+Foxp3+Treg細(xì)胞 表觀遺傳學(xué)
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R575.7
【目錄】：

• 前言9-16
• 參考文獻(xiàn)12-16
• 摘要16-19
• Abstract19-23
• 英文縮略詞表23-26
• 第一部分 炎性T細(xì)胞在膽道閉鎖小鼠中的表達(dá)及機(jī)制研究26-62
• 材料29-36
• 一、RRV病毒培養(yǎng)和病毒滴度測(cè)定29
• 二、Balb/c小鼠建立膽道閉鎖模型29-30
• 三、實(shí)驗(yàn)試劑30-32
• 四、試劑盒32
• 五、抗體32-33
• 六、實(shí)驗(yàn)材料33-34
• 七、儀器設(shè)備34-35
• 八、細(xì)胞和病毒35-36
• 方法36-45
• 一、小鼠肝臟中炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及分布36-37
• 二、肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)37-38
• 三、小鼠肝臟中調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離和檢測(cè)方法38
• 四、流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)IL-17Foxp3~+Treg細(xì)胞38-39
• 五、小鼠肝臟內(nèi)炎性Foxp3基因的表觀遺傳學(xué)的檢測(cè)39-44
• 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理44-45
• 結(jié)果45-57
• 一、膽道閉鎖發(fā)生率及癥狀表現(xiàn)45-48
• 二、肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)48-50
• 三、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在小鼠肝臟中分布50-51
• 四、調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在小鼠肝臟CD4+細(xì)胞中的比例51-53
• 五、IL-17~+Foxp3~+細(xì)胞和IL-17~-Foxp3~+細(xì)胞中CD25的表達(dá)53
• 六、IL-17~+Foxp3~+細(xì)胞和IL-17~-Foxp3~+細(xì)胞CD4~+T細(xì)胞中的比例53-55
• 七、小鼠肝臟內(nèi)Foxp3~+Treg細(xì)胞甲基化的檢測(cè)55-57
• 討論57-60
• 參考文獻(xiàn)60-62
• 第二部分 Foxp3基因甲基化調(diào)控在小鼠膽道閉鎖肝臟炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的作用影響62-102
• 材料65-72
• 一、Balb/c小鼠建立膽道閉鎖模型65
• 二、實(shí)驗(yàn)試劑65-67
• 三、試劑盒67-68
• 四、抗體68
• 五、實(shí)驗(yàn)材料68-69
• 六、儀器設(shè)備69-71
• 七、細(xì)胞和病毒71-72
• 方法72-84
• 一、小鼠肝臟中炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的表達(dá)及分布72-73
• 二、Aza干預(yù)后小鼠肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)73-74
• 三、實(shí)時(shí)熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測(cè)Foxp3、ROR-γ t和IL-17mRNA及其相關(guān)蛋白的表達(dá)74-78
• 四、Aza干預(yù)后小鼠肝臟中炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞的分離和檢測(cè)78
• 五、Aza干預(yù)后小鼠肝臟內(nèi)炎性T細(xì)胞表觀遺傳學(xué)的檢測(cè)78-83
• 六、統(tǒng)計(jì)學(xué)處理83-84
• 結(jié)果84-96
• 一、Aza干預(yù)后炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在小鼠肝臟CD4~+細(xì)胞中的比例84-87
• 二、Aza干預(yù)后調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在小鼠肝臟中的分布87-89
• 三、Aza干預(yù)后肝臟內(nèi)細(xì)胞因子的檢測(cè)89-90
• 四、Aza干預(yù)后檢測(cè)膽道閉鎖小鼠Foxp3,IL-17A以及ROR-γ t基因和蛋白表達(dá)的變化90-92
• 五、Aza干預(yù)后炎性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞亞群在小鼠肝臟CD4~+細(xì)胞中的比例92-93
• 六、Aza干預(yù)后小鼠肝臟內(nèi)Foxp3~+Treg細(xì)胞甲基化的檢測(cè)93-96
• 討論96-99
• 參考文獻(xiàn)99-102
• 結(jié)論102-103
• 綜述103-116
• 參考文獻(xiàn)111-116
• 致謝116-118
• 附錄 在校攻讀學(xué)位期間發(fā)表論文118

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5 韓青青;Th22細(xì)胞及其效應(yīng)因子IL-22與類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎及合并間質(zhì)性肺病相關(guān)性的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

6 張騰飛;吉西他濱與AMD3100聯(lián)合應(yīng)用于膽管癌RBE細(xì)胞株對(duì)CXCR4/CXCL12軸的作用[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

7 王們X ;EAAL細(xì)胞聯(lián)合全反式維甲酸對(duì)人肺腺癌細(xì)胞株A549體內(nèi)外作用的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

8 李超楠;兩種典型OPFRs對(duì)PC12細(xì)胞的神經(jīng)毒性及其機(jī)制探究[D];中國(guó)人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院;2015年

9 楊明;促腎上腺皮質(zhì)激素釋放因子1型受體經(jīng)cAMP/PKA信號(hào)通路對(duì)U87MG細(xì)胞凋亡機(jī)制的研究[D];河北醫(yī)科大學(xué);2015年

10 李廣康;RNAi沉默Rap2B基因?qū)盒赞D(zhuǎn)化BEAS-2B細(xì)胞的作用[D];鄭州大學(xué);2015年

本文編號(hào)：911010