發(fā)布時(shí)間：2017-09-20 18:24

  本文關(guān)鍵詞：熊果酸對(duì)原代肝星狀細(xì)胞活化過(guò)程中NOX-Hedgehog信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響

  更多相關(guān)文章： 原代肝星狀細(xì)胞 熊果酸 Hedgehog信號(hào)通路 NADPH氧化酶 Rac1 TGF-β

【摘要】：背景:肝纖維化是由多種病因所引起的慢性肝臟疾病的共同病理過(guò)程,其主要特征為細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)增生與降解失衡,導(dǎo)致肝臟內(nèi)ECM過(guò)度沉積。活化的肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cells,HSCs)是ECM產(chǎn)生的主要細(xì)胞來(lái)源,因此,原代肝星狀細(xì)胞(Quiescent hepatic stellate cells,Q-HSCs)的激活、增殖并轉(zhuǎn)化為成纖維細(xì)胞樣肝星狀細(xì)胞(myofibroblastic hepatic stellate cells,MF-HSCs)在肝纖維化發(fā)生發(fā)展過(guò)程中起著關(guān)鍵性作用。Hedgehog(Hh)信號(hào)通路在肝臟胚胎發(fā)育以及成熟肝臟的損傷修復(fù)過(guò)程發(fā)揮著重要的作用。越來(lái)越多研究表明,Hh信號(hào)通路的持續(xù)激活促進(jìn)Q-HSC轉(zhuǎn)化為MF-HSC,進(jìn)而促進(jìn)肝纖維化發(fā)展。NADPH氧化酶(NADPH oxidase,NOX)參與介導(dǎo)一系列促纖維化信號(hào)通路,有學(xué)者研究發(fā)現(xiàn),NOX亞基Rac1參與了對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控,它能激活Hh通路,進(jìn)而促使Q-HSC激活轉(zhuǎn)化為MF-HSC。我們前期研究發(fā)現(xiàn)熊果酸能顯著抑制瘦素誘導(dǎo)的HSC-T6中NOX亞基Rac1蛋白表達(dá),進(jìn)而抑制Hh信號(hào)通路活性�；谝陨涎芯考扒捌谘芯砍晒�,本研究將進(jìn)一步以原代HSC為研究對(duì)象,觀察Q-HSC轉(zhuǎn)化過(guò)程中NOX對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控作用及熊果酸對(duì)該信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的的影響。目的:觀察Q-HSC活化轉(zhuǎn)化過(guò)程中NOX對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控作用,明確熊果酸對(duì)NOX-Hh信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響及機(jī)制。方法:取分離提取長(zhǎng)至第5天的原代肝星狀細(xì)胞,隨機(jī)分成以下各組:正常對(duì)照組;熊果酸組(40μM);TGF-β組(5μg/L);熊果酸干預(yù)組(TGF-β+熊果酸);DPI干預(yù)組(TGF-β+DPI 10μM)。干預(yù)組分別給予熊果酸和DPI(NOX特異性抑制劑)預(yù)處理半小時(shí)之后再加入TGF-β,各組經(jīng)相應(yīng)藥物作用12h后,提取細(xì)胞總RNA,用q RT-PCR法檢測(cè)藥物處理后HSC對(duì)I型膠原和α-平滑肌肌動(dòng)蛋白(α-SMA)m RNA表達(dá)以及Hh信號(hào)通路中Shh、Smo、Gli2和NOX亞基Rac1的m RNA表達(dá);藥物作用24小時(shí)后,提取每組HSC總蛋白,采用Western blotting分別檢測(cè)Rac1、Shh、Smo、Gli2及α-SMA蛋白表達(dá)。結(jié)果:1.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中I型膠原m RNA、α-SMA m RNA表達(dá)的影響TGF-β刺激原代HSC12h后,I型膠原和α-SMA m RNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.01);熊果酸自身對(duì)照組I型膠原和α-SMA m RNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.05;P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其I型膠原和α-SMA m RNA水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比I型膠原和α-SMA m RNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,原代HSC在活化過(guò)程中I型膠原和α-SMA m RNA表達(dá)明顯升高,而熊果酸干預(yù)能抑制原代HSC活化過(guò)程中I型膠原和α-SMA m RNA表達(dá)。2.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Rac1 m RNA表達(dá)的影響TGF-β刺激原代HSC 12h后,Rac1 m RNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.01);熊果酸自身對(duì)照組Rac1 m RNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Rac1 m RNA水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.05),并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1 m RNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,原代HSC在活化過(guò)程中NOX亞基Rac1表達(dá)上調(diào),熊果酸可抑制原代HSC活化過(guò)程中NOX亞基Rac1 m RNA的表達(dá)。3.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Shh、Smo、Gli2 m RNA表達(dá)的影響TGF-β刺激原代HSC 12h后,Shh、Smo、Gli2 m RNA的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.01;P0.01;P0.05);熊果酸自身對(duì)照組Shh、Smo、Gli2 m RNA表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.01;P0.01;P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Shh、Smo、Gli2 m RNA水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh、Smo、Gli2 m RNA的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,原代HSC在活化過(guò)程中Hh信號(hào)通路的Shh、Smo、Gli2基因表達(dá)上調(diào),NOX參與了Shh、Smo、Gli2基因表達(dá)的調(diào)控,熊果酸可抑制原代HSC活化過(guò)程中Shh、Smo、Gli2 m RNA的表達(dá)。TGF-β刺激原代HSC 24h后,α-SMA蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.01);熊果酸自身對(duì)照組α-SMA蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.05);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其α-SMA蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比α-SMA蛋白表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。由于α-SMA蛋白是HSC活化的標(biāo)志,以上結(jié)果說(shuō)明NOX介導(dǎo)了TGF-β誘導(dǎo)的原代HSC活化,熊果酸可抑制原代HSC活化。5.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Rac1蛋白表達(dá)的影響TGF-β刺激原代HSC 24h后,Rac1蛋白表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.05);熊果酸自身對(duì)照組Rac1蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Rac1蛋白水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Rac1蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,原代HSC活化過(guò)程中NOX亞基Rac1表達(dá)上調(diào),熊果酸可抑制原代HSC活化過(guò)程中NOX亞基Rac1蛋白的表達(dá)。6.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)的影響TGF-β刺激原代HSC 24h后,Shh、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)比空白對(duì)照組明顯增加(P0.05;P0.05;P0.01);熊果酸自身對(duì)照組Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)明顯低于空白對(duì)照組(P0.01);在TGF-β刺激原代HSC之前加入熊果酸進(jìn)行干預(yù)后其Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)水平較TGF-β刺激組顯著降低(P0.01),并且與NOX的抑制劑DPI相比Shh、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。以上結(jié)果說(shuō)明,原代HSC在活化過(guò)程中Hh信號(hào)通路的Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)上調(diào),NOX參與了Shh、Smo、Gli2蛋白表達(dá)的調(diào)控,熊果酸可抑制原代HSC活化過(guò)程中Shh、Smo、Gli2蛋白的表達(dá)。4.熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中α-SMA蛋白表達(dá)的影響結(jié)論:1、TGF-β誘導(dǎo)Q-HSC激活轉(zhuǎn)化為MF-HSC過(guò)程中NOX參與調(diào)控Hh信號(hào)通路Shh、Smo、Gli2的基因和蛋白表達(dá)。2、熊果酸能抑制Q-HSC激活轉(zhuǎn)化過(guò)程中Hh信號(hào)通路Shh、Smo、Gli2表達(dá),并抑制I型膠原及α-SMA表達(dá),其機(jī)制可能通過(guò)抑制NOX的活性與亞基表達(dá)有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：原代肝星狀細(xì)胞 熊果酸 Hedgehog信號(hào)通路 NADPH氧化酶 Rac1 TGF-β
【學(xué)位授予單位】：南昌大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 摘要3-7
• Abstract7-14
• 第1章 引言14-17
• 第2章 材料與方法17-27
• 2.1 材料17-19
• 2.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物17
• 2.1.2 主要試劑17-18
• 2.1.3 主要儀器18-19
• 2.2 研究方法19-26
• 2.2.1 主要液體的配制19-21
• 2.2.2 原代HSC分離提取、培養(yǎng)與鑒定21-22
• 2.2.3 實(shí)驗(yàn)分組及藥物處理22-23
• 2.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測(cè)I型膠原、α-SMA、NOX亞基Rac1以及Hh信號(hào)通路mRNA的表達(dá)23-25
• 2.2.5 Western-blotting檢測(cè)原代HSC細(xì)胞蛋白的表達(dá)25-26
• 2.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理26-27
• 第3章 結(jié)果27-39
• 3.1 原代HSC純度、活性、靜息態(tài)及活化狀態(tài)鑒定27
• 3.2 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中I型膠原m RNA表達(dá)的影響27-28
• 3.3 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中 α-SMA表達(dá)的影響28-30
• 3.3.1 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中 α-SMA mRNA表達(dá)的影響28-29
• 3.3.2 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中 α-SMA蛋白表達(dá)的影響29-30
• 3.4 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中NOX亞基Rac1表達(dá)的影響30-32
• 3.4.1 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Rac1 mRNA表達(dá)的影響30-31
• 3.4.2 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Rac1蛋白表達(dá)的影響31-32
• 3.5 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Hedgehog信號(hào)通路的影響32-39
• 3.5.1 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Shh mRNA表達(dá)的影響32-33
• 3.5.2 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Smo mRNA表達(dá)的影響33-34
• 3.5.3 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Gli2 mRNA表達(dá)的影響34-35
• 3.5.4 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Shh蛋白表達(dá)的影響35-36
• 3.5.5 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Smo蛋白表達(dá)的影響36-37
• 3.5.6 熊果酸對(duì)Q-HSC活化過(guò)程中Gli2蛋白表達(dá)的影響37-39
• 第4章 討論39-44
• 4.1 NOX對(duì)Hh信號(hào)通路的調(diào)控39
• 4.2 TGF-β 及NOX-Hh信號(hào)通路在HSC激活轉(zhuǎn)化中的作用及機(jī)制39-40
• 4.3 熊果酸的抗肝纖維化作用及機(jī)制40-41
• 4.4 熊果酸對(duì)原代HSC活化過(guò)程中Hh信號(hào)通路的影響41-42
• 4.5 熊果酸對(duì)原代HSC中NOX-Hh信號(hào)網(wǎng)絡(luò)的影響42-44
• 第5章 結(jié)論與展望44-45
• 5.1 結(jié)論44
• 5.2 展望44-45
• 致謝45-46
• 參考文獻(xiàn)46-50
• 附圖50-53
• 攻讀學(xué)位期間的研究成果53-54
• 綜述54-59
• 參考文獻(xiàn)57-59

【參考文獻(xiàn)】

中國(guó)期刊全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前8條

1 陳濤;何文華;朱萱;黃雯;余珊珊;陳標(biāo);黃德強(qiáng);;熊果酸對(duì)血管緊張素Ⅱ誘導(dǎo)肝星狀細(xì)胞內(nèi)NADPH氧化酶的活化及下游信號(hào)通路的影響[J];上海交通大學(xué)學(xué)報(bào)(醫(yī)學(xué)版);2015年01期

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3 陳璐;何文華;朱萱;李弼民;張q和;施鳳;張新華;;熊果酸對(duì)肝星狀細(xì)胞NADPH氧化酶-Hedgehog信號(hào)通路的影響[J];第三軍醫(yī)大學(xué)學(xué)報(bào);2014年05期

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5 李博;李弼民;何文華;劉志堅(jiān);張q和;陳江;劉戈云;張新華;朱萱;;熊果酸對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)活性氧產(chǎn)生的影響及與細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J];廣東醫(yī)學(xué);2011年11期

6 張新華;朱萱;;NOX通過(guò)ROS介導(dǎo)的信號(hào)通路與肝纖維化[J];國(guó)際消化病雜志;2011年01期

7 何文華;朱萱;;NADPH氧化酶產(chǎn)生的活性氧簇對(duì)肝星狀細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的調(diào)控[J];世界華人消化雜志;2008年17期

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本文編號(hào)：889679