本文關鍵詞：抗肝纖維化新型異喹啉類化合物的篩選及機制研究

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【摘要】：背景與目的:活化的HSC凋亡障礙是肝纖維化難以逆轉的主要原因。異喹啉生物堿具有明顯細胞毒作用,可顯著誘導腫瘤細胞凋亡。為了保留異喹啉生物堿促凋亡活性并降低其細胞毒性,與復旦大學化學系合作,我們構建了新型異喹啉類小分子化合物庫。本課題的目的是從新型異喹啉類小分子庫篩選出細胞毒性低促凋亡生物活性強的具有抗肝纖維化作用的新型異喹啉小分子化合物,由此希望研發(fā)出一類新型抗肝纖維化藥物先導化合物。方法:小分子化合物的篩查:(1)將復旦大學化學系合成的小分子化合物分類整理。(2)MTT法檢測不同小分子化合物不同濃度(0μg/ml,2.5μg/ml,5μg/ml,10μg/ml,20μg/ml,40μg/ml,80μg/ml)處理HSC-T6細胞24小時后,HSC增殖改變,并計算IC50值。(3)Hochest法檢測上述篩選出的陽性化合物(IC50100μg/ml)對HSC-T6細胞凋亡能力的影響。12-4-Y促HSC凋亡機制的探索:(1)MTT法檢測不同濃度12-4-Y處理HSC-T6不同時間(12h、24h、36h、48h)后HSC增殖變化,臺盼藍染色評估細胞活力;(2)Hoechst染色檢測凋亡小體;(3)流式細胞術對細胞凋亡進行定性檢測;(4)檢測凋亡關鍵蛋白Caspase3及其活化形式的表達變化;(5)Real time PCR檢測凋亡相關基因表達變化。結果:(1)MTT結果提示,所構建的類天然小分子化合物庫中存在6種化合物(12-4-Y、12-1-Y、09-4-Y、15-1-Y、11-2-Y、09-3-Y)對HSC-T6細胞增殖有明顯的抑制作用,并且呈濃度依賴性,這6種陽性化合物的IC50值都在100μg/ml以內(nèi)。(2)Hochest染色結果顯示,上述陽性化合物中有1種化合物處理HSC-T6后可見明顯的凋亡小體。這種化合物的編號為12-4-Y(1-乙基-8-甲氧基-5苯基吡唑并[5,1-a]異喹啉)。(3)進一步以不同濃度的12-4-Y處理HSC-T6細胞株后,MTT顯示12-4-Y在12-48h及5-80μg/ml范圍內(nèi)可呈時間及濃度依賴性抑制HSC-T6增殖,臺盼藍染色顯示40μg/ml 12-4-Y處理HSC-T6細胞系12h后細胞藍染(0.53±0.04)%,與對照組(0.98±0.02)%相比明顯增多(P0.05);(4)20μg/ml 12-4-Y處理HSC-T6細胞系24h后,Hoechst染色結果提示HSC-T6細胞系內(nèi)可見較多的凋亡小體,同時流式細胞儀凋亡定量檢測分析提示凋亡率為(29.23±1.20)%,顯著高于對照組(5.47±1.39)%(P0.001);(5)Western blot結果提示凋亡關鍵蛋白Caspase3的裂解產(chǎn)物表達較空白對照組顯著增加。(6)Real time PCR結果提示10μg/ml、20μg/ml 12-4-Y與HSC-T6共孵育24h后,線粒體凋亡途徑相關的促凋亡基因Bax、Caspase9的表達顯著上調(diào),抑制凋亡相關基因Bcl2表達明顯下調(diào)(P0.05)。結論:從異喹啉類小分子化合物庫中,我們篩選到6種新型異喹啉類小分子化合物對大鼠肝星狀細胞HSC-T6的增殖具有抑制作用;發(fā)現(xiàn)1種新型異喹啉類小分子化合物(12-4-Y)能顯著誘導HSC-T6凋亡,其機制可能與激活線粒體凋亡途徑相關。
【關鍵詞】：肝纖維化 肝星狀細胞 異喹啉化合物 細胞凋亡
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 摘要5-7
• ABSTRACT7-11
• 中英文縮略語11-13
• 緒論13-17
• 第一部分 抗肝纖維化新型異喹啉類化合物的篩選17-27
• 引言17-18
• 1. 材料與方法18-22
• 1.1 材料18-19
• 1.1.1 實驗細胞18
• 1.1.2 實驗所用化合物18
• 1.1.3 實驗試劑18
• 1.1.4 實驗材料18
• 1.1.5 實驗儀器18-19
• 1.2 方法19-22
• 1.2.1 細胞培養(yǎng)19
• 1.2.2 細胞處理及分組19-20
• 1.2.3 MTT法檢測細胞增殖20-21
• 1.2.4 Hoechst染色法檢測細胞凋亡21-22
• 2. 結果22-25
• 2.1 不同化合物作用HSC后細胞活力改變22-24
• 2.2 不同化合物對細胞凋亡的作用24-25
• 3. 討論25-27
• 第二部分 新型異喹啉化合物促肝星狀細胞凋亡機制研究27-49
• 引言27-29
• 1 材料與方法29-39
• 1.1 材料29-32
• 1.1.1 實驗化合物29
• 1.1.2 實驗細胞29
• 1.1.3 實驗試劑29-31
• 1.1.4 試劑配制31
• 1.1.5 實驗耗材及儀器31-32
• 1.2 試驗方法32-39
• 1.2.1 大鼠活化肝星狀細胞的培養(yǎng)與MTT檢測32-33
• 1.2.2 細胞周期檢測33-34
• 1.2.3 凋亡定性（凋亡小體）檢測34
• 1.2.4 凋亡定量（流式細胞術）檢測34-35
• 1.2.5 Western blot檢測caspase3及其活化形式的表達變化35-37
• 1.2.6 Realtime PCR檢測凋亡相關基因表達變化37-39
• 1.2.7 統(tǒng)計學處理39
• 2 結果39-45
• 2.1 124Y對HSC細胞系增殖的影響39-42
• 2.1.1 MTT實驗檢測 124Y對HSC-T6細胞系增殖抑制效果39-40
• 2.1.2 細胞周期檢測 124Y對HSC-T6是否有周期阻滯作用40-42
• 2.2 124Y促進HSC細胞系凋亡的效果42-43
• 2.2.1 HSC凋亡的定性檢測：Hoechst檢測凋亡小體42
• 2.2.2 HSC凋亡的定量檢測：流式細胞儀檢測42-43
• 2.3 124Y促進HSC凋亡機制的初探43-45
• 2.3.1 Western blot檢測caspase3及其活化形式表達變化43-44
• 2.3.2 Real-time PCR檢測凋亡相關基因表達的變化44-45
• 3 討論45-49
• 結論49-50
• 參考文獻50-61
• 致謝61-63
• 攻讀學位期間發(fā)表的學術論文目錄63

【參考文獻】

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本文編號：884907