本文關(guān)鍵詞：EPAC對(duì)乙醛誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和激活的作用

  更多相關(guān)文章： 乙醛 大鼠肝星狀細(xì)胞 EPAC1 EPAC2 Rap1

【摘要】：酒精性肝病(alcoholic liver disease, ALD)是由于長(zhǎng)期大量飲酒而導(dǎo)致的肝臟損害性病變。酒精性肝纖維化(alcoholic liver fibrosis, ALF)是ALD進(jìn)展為酒精性肝硬化或肝癌的中間階段和必經(jīng)病理過(guò)程。在ALF的發(fā)生過(guò)程中,乙醇可通過(guò)其直接代謝產(chǎn)物乙醛激活肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC),活化的HSC是肝纖維化過(guò)程中細(xì)胞外基質(zhì)(Extra cellular matrix,ECM)的主要來(lái)源,也是各種因素所致肝纖維化發(fā)生的核心和關(guān)鍵環(huán)節(jié)。cAMP信號(hào)通路是細(xì)胞內(nèi)非常重要的信號(hào)傳遞途徑之一,最初認(rèn)為蛋白激酶A(PKA)是其唯一的下游效應(yīng)因子。cAMP/PKA通過(guò)磷酸化cAMP反應(yīng)序列結(jié)合蛋白(CREB)的Ser-133位點(diǎn)使之活化,然后作用于cAMP反應(yīng)序列影響基因表達(dá),進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞的生長(zhǎng)、分化。課題組前期研究已經(jīng)探討了cAMP/PKA/CREB信號(hào)通路在大鼠酒精性肝纖維化模型和乙醛刺激的大鼠肝星狀細(xì)胞中的作用。EPAC(exchange protein directly activated by cAMP)是一種由cAMP激活的鳥(niǎo)嘌呤核苷酸交換因子(guanine nucleotide exchange factors,GEFs),又稱為cAMP-GEF,是1998年de Rooij等新發(fā)現(xiàn)的獨(dú)立于PKA的cAMP下游效應(yīng)因子,在許多重要的細(xì)胞生理病理進(jìn)程中都發(fā)揮重要的調(diào)控作用。這提示了cAMP細(xì)胞中的效應(yīng)可能不只是由以前鑒定的靶蛋白所介導(dǎo)。cAMP通過(guò)EPAC活化Rapl, Rapl是Ras樣的小分子G蛋白,通過(guò)與EPAC結(jié)合而被活化,EPAC能增加這類小分子G蛋白對(duì)GTP的攝取并使之形成有活性的GTP結(jié)合構(gòu)象。目前為止已發(fā)現(xiàn)了兩種EPAC亞型：EPAC1 (RapGEF3)和EPAC2 (RapGEF4),由不同的基因編碼。那么,EPAC基因是否在大鼠肝星狀細(xì)胞中表達(dá)呢?如果表達(dá)又起到什么樣的作用呢?是否和PKA作用相同?因此,本課題的研究?jī)?nèi)容是在采用乙醛誘導(dǎo)HSC-T6細(xì)胞建立離體大鼠酒精性肝纖維化HSC模型的基礎(chǔ)上,運(yùn)用RNA干擾技術(shù)和EPAC激動(dòng)劑,觀察EPAC1和EPAC2的表達(dá)對(duì)α-SMA、Collagen Ⅰ、Collagen Ⅲ表達(dá)的影響,為酒精性肝纖維化的防治提供新的靶點(diǎn)。主要內(nèi)容概括如下：1.EPAC在大鼠肝星狀細(xì)胞中的表達(dá)情況實(shí)驗(yàn)采用大鼠HSC-T6細(xì)胞系為研究對(duì)象,用濃度為200μM乙醛處理細(xì)胞48 h,實(shí)時(shí)熒光定量PCR (qRT-PCR)、Western blot分別檢測(cè)EPAC1和EPAC2的mRNA與蛋白的表達(dá)水平。結(jié)果顯示,EPAC1和EPAC2在正常HSC均有表達(dá),與正常組比較,經(jīng)200μM乙醛作用48 h后,HSC模型組EPAC2表達(dá)水平明顯增高,而EPAC1表達(dá)水平顯著下降。提示EPAC1和EPAC2在乙醛誘導(dǎo)的HSC中可能起到不同的作用。2. EPAC對(duì)乙醛刺激的HSC—T6增殖和激活的作用實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)), 模型組,EPAC激動(dòng)劑(8-(4-Chlorophenylthio)-2'-O-methyladenosine 3',5'-cyclic monophosphate monosodium hydrate, Me-cAMP)組。除正常對(duì)照組外其余各組均以200μM乙醛作用48 h,制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。Me-cAMP組在乙醛作用24 h后再加入Me-cAMP繼續(xù)共同作用24 h。利用MTT法檢測(cè)Me-cAMP對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)Me-cAMP對(duì)細(xì)胞周期的影響。qRT-PCR及Westernblot法分別檢測(cè)HSC-T6的α-SMA、Ⅰ型和III膠原mRNA和蛋白表達(dá)以及Rapl的蛋白表達(dá)。與模型組比較,Me-cAMP明顯增加了EPAC1和2的表達(dá),使EPAC1的表達(dá)升高了約三倍,并且使細(xì)胞增殖活力明顯下降。流式細(xì)胞分析表明Me-cAMP使S期和G2/M期細(xì)胞數(shù)目比例顯著下降。qRT-PCR及Western blot實(shí)驗(yàn)表明α-SMA、Ⅰ型和Ⅲ膠原的表達(dá)與模型組比較,均呈現(xiàn)出顯著下降。當(dāng)EPAC被激活之后,EPAC的下游分子Rap1活性形式Rap1-GTP的蛋白表達(dá)也同樣上升。以上結(jié)果提示,在HSC存在EPAC/Rap1信號(hào)通路,并且EPAC激活后,乙醛誘導(dǎo)的的HSC-T6的激活和增殖均受到抑制。3、EPAC siRNA在乙醛刺激的HSC—T6中的作用建立上述HSC模型,設(shè)計(jì)并合成EPAC1和EPAC2小干擾RNA (small interfering RNA,siRNA),通過(guò)脂質(zhì)體Lipofectamine TM 2000瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi),熒光倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率,同樣利用MTT法檢測(cè)EPAC siRNA對(duì)細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞儀檢測(cè)其對(duì)細(xì)胞周期的影響；qRT-PCR及Western blot法分別檢測(cè)HSC-T6的a-SMA、CollagenⅠ、CollagenⅢ mRNA及蛋白表達(dá)。將EPAC1和EPAC2 siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi),與陰性對(duì)照組相比EPAC1和2表達(dá)水平明顯降低。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果說(shuō)明單獨(dú)應(yīng)用EPAC1 siRNA和同時(shí)應(yīng)用EPAC1和2 siRNA均使乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖活力增強(qiáng),而單獨(dú)應(yīng)用EPAC2 siRNA可使乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6細(xì)胞增殖活力減弱。細(xì)胞周期結(jié)果也表明只有單獨(dú)應(yīng)用EPAC2 siRNA使S期和G2/M期的細(xì)胞數(shù)目比例顯著下降。當(dāng)靶向封閉EPAC1和EPAC2基因的表達(dá)時(shí),α-SMA、I型和III膠原mRNA及蛋白表達(dá)亦明顯降低。將EPAC1 siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi),α-SMA、型和III膠原mRNA及蛋白表達(dá)升高;將EPAC2 siRNA轉(zhuǎn)染至HSC-T6細(xì)胞內(nèi),α-SMA、I型和III膠原mRNA及蛋白表達(dá)降低。上述結(jié)果說(shuō)明,EPAC2沉默可抑制乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6活化與增殖,而EPAC1沉默進(jìn)一步加強(qiáng)了乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6活化與增殖。4、EPAC和PKA激活對(duì)乙醛刺激的HSC—T6表達(dá)I型和III膠原及α-SMA的作用不同實(shí)驗(yàn)設(shè)正常對(duì)照組(常規(guī)培養(yǎng)),模型組,Me-cAMP組,PKA激動(dòng)劑(N6-phenyladenosine-3,5-cyclic monophosphate, Phe-cAMP)組,除正常對(duì)照組外其余各組均以200 μM乙醛作用48 h,制備大鼠酒精性肝纖維化HSC模型。Me-cAMP和Phe-cAMP組在乙醛作用24 h后再加入繼續(xù)共同作用24 h。qRT-PCR及Western blot法分別檢測(cè)HSC-T6的α-SMA、I型和Ⅲ膠原mRNA和蛋白表達(dá)以及Rap1的蛋白表達(dá)。與模型組相比,Me-cAMP抑制了細(xì)胞中α-SMA,I型和Ⅲ膠原的蛋白的表達(dá)；而PKA激動(dòng)劑Phe-cAMP促進(jìn)了α-SMA, collagen I和Ⅲ的蛋白的表達(dá),與課題組前期研究結(jié)果一致。EPAC激動(dòng)劑可使小G蛋白R(shí)ap1活性形式Rap1-GTP表達(dá)增多,而PKA激動(dòng)劑Phe-cAMP卻對(duì)Rap1和GTP結(jié)合影響不大。這些數(shù)據(jù)表明,在乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6中EPAC和PKA的激活對(duì)α-SMA,I型和Ⅲ膠原表達(dá)可能起到不同的作用；而EPAC可能通過(guò)Rap1發(fā)揮作用。綜上所述,在大鼠酒精肝纖維化HSC模型中,EPAC2表達(dá)較正常組升高,而EPAC1的表達(dá)降低。 使用EPAC激動(dòng)劑Me-cAMP和沉默EPAC2基因的表達(dá)均可明顯抑制HSC-T6細(xì)胞的活化增殖。EPAC激動(dòng)劑Me-cAMP不僅較大程度的增加了EPAC1的表達(dá),而且增加了EPAC下游Rap1活性形式Rap 1-GDP的表達(dá)。運(yùn)用EPAC激動(dòng)劑Me-cAMP和PKA激動(dòng)劑Phe-cAMP發(fā)現(xiàn)在乙醛誘導(dǎo)的HSC-T6中EPAC和PKA的激活對(duì)α-SMA,Ⅰ型和Ⅲ膠原表達(dá)可能起到不同的作用;而EPAC可能通過(guò)Rap1發(fā)揮作用。以上結(jié)果說(shuō)明EPAC/Rap1信號(hào)通路激活可以抑制乙醛誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞激活和增殖。
【關(guān)鍵詞】：乙醛 大鼠肝星狀細(xì)胞 EPAC1 EPAC2 Rap1
【學(xué)位授予單位】：安徽醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575
【目錄】：

• 英文縮略詞5-7
• 中文摘要7-11
• 英文摘要11-15
• 1 前言15-16
• 2 實(shí)驗(yàn)材料16-22
• 3 實(shí)驗(yàn)方法22-31
• 4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果31-44
• 5 討論44-48
• 6 結(jié)論48-49
• 參考文獻(xiàn)49-54
• 附錄54-55
• 致謝55-56
• 綜述56-67
• 參考文獻(xiàn)63-67

【相似文獻(xiàn)】

中國(guó)重要會(huì)議論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前2條

1 戴志娟;陳永平;程瑗;葉超;金曉芝;林鐲;張磊;谷甸娜;;Epac在大鼠肝纖維化模型中的動(dòng)態(tài)變化[A];第四屆中國(guó)醫(yī)師協(xié)會(huì)感染科醫(yī)師大會(huì)暨傳染病診治高峰論壇、浙江省醫(yī)學(xué)會(huì)肝病、感染病學(xué)學(xué)術(shù)年會(huì)論文匯編[C];2011年

2 戴志娟;陳永平;程瑗;葉超;金曉芝;林鐲;張磊;谷甸娜;;Epac在大鼠肝纖維化模型中的動(dòng)態(tài)變化[A];第二十次全國(guó)中西醫(yī)結(jié)合肝病學(xué)術(shù)會(huì)議論文匯編[C];2011年

中國(guó)碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 楊巖;EPAC對(duì)乙醛誘導(dǎo)的大鼠肝星狀細(xì)胞增殖和激活的作用[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2016年

，

本文編號(hào)：877161