本文關(guān)鍵詞：不同長(zhǎng)度戊型肝炎病毒ORF2截短蛋白的免疫原性和抗原性研究

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【摘要】：戊型肝炎(hepatitis E, HE)是由戊型肝炎病毒(hepatitis E virus, HEV)引起的一種經(jīng)消化道傳播的傳染病,常因糞便污染水源而引起暴發(fā)流行,臨床上主要表現(xiàn)為急性肝炎,在孕婦中病死率高達(dá)20%,慢性肝病患者合并HEV感染易引發(fā)肝功能衰竭。此外,近年發(fā)現(xiàn)在器官移植和免疫缺陷患者中戊型肝炎可以慢性化并導(dǎo)致肝纖維化。戊型肝炎在發(fā)展中國(guó)家多見,但由于HEV的動(dòng)物源性特點(diǎn),近年在發(fā)達(dá)國(guó)家發(fā)病數(shù)也大幅增加,我國(guó)在2012年戊型肝炎發(fā)病人數(shù)已超過(guò)甲型肝炎發(fā)病人數(shù),成為一個(gè)嚴(yán)重的公共衛(wèi)生問題。因此,加強(qiáng)戊型肝炎疫苗的研發(fā)并及時(shí)推廣應(yīng)用對(duì)預(yù)防和控制戊型肝炎意義重大。HEV是一種RNA病毒,無(wú)包膜,基因組含有ORF1、ORF2和ORF3三個(gè)讀碼框架。其中ORF2編碼的結(jié)構(gòu)蛋白(pORF2)全長(zhǎng)660個(gè)氨基酸(amino acid、aa),位于病毒表面,構(gòu)成病毒的衣殼。我們前期的研究發(fā)現(xiàn)HEV ORF2基因編碼蛋白C端452-617aa的重組蛋白(p166)含有HEV構(gòu)型依賴性中和抗原表位,也是HEV的主要抗原表位,因此p166可作為包被抗原,應(yīng)用間接法ELISA檢測(cè)血清中抗-HEV。在此基礎(chǔ)上我們利用大腸桿菌表達(dá)了含有HEV中和抗原表位的可溶性pORF2截短蛋白p179 (aa439-617),發(fā)現(xiàn)p179能夠有效誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生高滴度的HEV中和抗體,能夠保護(hù)動(dòng)物抵抗HEV的攻擊,可以用于戊型肝炎重組疫苗的研發(fā)。目前該p179疫苗已進(jìn)入臨床試驗(yàn)階段。本論文是在p166,p179蛋白的研究基礎(chǔ)上分別進(jìn)行了N端和C端的延長(zhǎng),構(gòu)建出了3個(gè)包含有更多抗原表位的新的HEV pORF2截短蛋白并對(duì)其免疫原性和抗原性進(jìn)行研究,旨在為戊型肝炎重組疫苗的進(jìn)一步研發(fā)提供更多的科學(xué)依據(jù)。研究結(jié)果主要分為以下三個(gè)部分：一. 截短蛋白pORF2aa439～660、PORF2aa422～637、pORF2aa430～660的原核表達(dá)及其特性分析由于蛋白質(zhì)能否有效表達(dá)很難預(yù)測(cè),實(shí)驗(yàn)早期以p179為基礎(chǔ)共設(shè)計(jì)了20個(gè)不同長(zhǎng)度的pORF2截短片段進(jìn)行表達(dá)嘗試。利用基因重組技術(shù)構(gòu)建了含有HEV ORF2的pET28a重組質(zhì)粒,并在大腸桿菌中進(jìn)行表達(dá),其中13個(gè)截短蛋白可以得到高效表達(dá),并將這些蛋白分別命名為pORF2aa439～627、pORF2aa439～637、pORF2aa439～647、 pORF2aa439～660、pORF2aa422～617、pORF2aa422～627、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～617、pORF2aa430～647、pORF2aa430～660、pORF2aa402～606、 pORF2aa410～606和pORF2aa419～606。在成功表達(dá)的13種蛋白中,我們選取了片段較長(zhǎng)的3個(gè)重組蛋白pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637和pORF2aa430～660進(jìn)行蛋白質(zhì)的可溶性分析,發(fā)現(xiàn)這3種不同長(zhǎng)度的蛋白都可以在細(xì)菌裂解上清中存在,呈可溶性表達(dá)。SDS-PAGE分析顯示pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和pORF2aa430～660分子質(zhì)量分別為24.4kDa、23.8kDa和25.4kDa,在天然狀態(tài)下呈二聚體。最后根據(jù)表達(dá)蛋白所攜帶的His標(biāo)簽,利用鎳離子金屬螫合親和層析技術(shù)獲得了純化蛋白。二.截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660與p179、p166免疫原性和抗原性的比較研究為了進(jìn)一步研究3種不同長(zhǎng)度的截短蛋白與p166、p179的免疫原性和抗原性的差異,將純化后的5種HEV重組蛋白以生理鹽水稀釋至100mg/L,然后分別加入等體積鋁佐劑(1g/L),顛倒混勻30mmin,即為制備的實(shí)驗(yàn)性戊肝疫苗。用皮內(nèi)注射的方法分別免疫5組小鼠,每組6只,每只200μl(含抗原10μg),并于首次免疫后的第3周,第5周及第33周各進(jìn)行1次加強(qiáng)免疫,免疫劑量和途徑與首次免疫相同。定期采集小鼠血清,分別用p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660作為包被抗原來(lái)檢測(cè)p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫后血清中的抗-HEV IgG抗體,觀察抗體滴度的升高、維持、下降等變化過(guò)程直至首次免疫后第35周,將同組小鼠的每一份血清在同一稀釋度下所測(cè)OD值取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)。結(jié)果如下：A.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p166免疫小鼠所得血清用p166包被檢測(cè),抗-HEV IgG抗體滴度分別為1：1600、1：6400、1：51200、1：25600、1：3200和1：51200；用p179、pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660包板檢測(cè),抗體滴度相同,分別為1：800、l：3200、1：25600、1：12800、1：3200、l：25600；B.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,p179免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè),抗-HEV IgG抗體滴度分別為1：3200、1：12800、1：51200、1：25600、1：6400、1：51200；用p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～660包板檢測(cè),所得抗體滴度相同,均分別為1：1600、1：12800、1：51200、1：12800、1：6400、1：51200；C.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa439～660免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè),抗-HEV IgG抗體滴度分別為1：12800、1：409600、1：1638400、1：204800、1：204800、1：1638400；用p179包被檢測(cè),抗體滴度分別為l：3200、1：102400、1：819200、1：102400、1：204800、1：1638400；用pORF2aa439～660檢測(cè),抗體滴度分別為1：6400、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；用pORF2aa422～637檢測(cè),抗體滴度分別為1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：1638400；用pORF2aa430～660檢測(cè),抗體滴度分別為1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；D.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa422～637免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè),抗-HEV IgG抗體滴度分別為1：6400、1：204800、1：819200、1：204800、1：204800、1：1638400；用p179檢測(cè),抗體滴度分別為1：3200、1：102400、1：819200、1：204800、1：204800、1：1638400；用pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660檢測(cè),抗體滴度相同均分別為1：6400、1：204800、1：819200、1：204800、1：204800、1：819200；E.首次免疫后第3周、第5周、第7周、第15周、第31周和第35周,pORF2aa430-660免疫小鼠所得血清用p166檢測(cè),抗-HEV IgG抗體滴度分別為1：6400、1：409600、1：819200、1：204800、1：204800、1：819200；用p179檢測(cè),抗體滴度分別為1：3200、1：102400、1：409600、1：204800、1：204800、1：819200；用pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660檢測(cè),抗體滴度相同均分別為1：6400、1：204800、1：409600、1：204800、l：204800、1：409600。F.運(yùn)用生物信息學(xué)分析軟件,對(duì)p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、 pORF2aa430～660的中和抗原表位的突出情況作了分析,結(jié)果顯示5種蛋白的中和抗原表位突出面積分別為12.93,12.01,9.681,11.24以及9.372,此數(shù)據(jù)說(shuō)明五種蛋白天然二聚體狀態(tài)下p166突出程度最明顯,pORF2aa430～660突出程度最弱,可以部分解釋p166的抗原性優(yōu)于其他4種截短蛋白的原因。綜合上述研究結(jié)果,我們發(fā)現(xiàn)在相同的免疫時(shí)間點(diǎn),pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠的血清滴度明顯高于p166、p179的血清滴度,說(shuō)明長(zhǎng)片段蛋白的免疫原性明顯好于短片段蛋白。此外,同一份血清,在相同滴度下,用p166包被檢測(cè)所得OD值的平均值大于其他4種蛋白所檢測(cè)的OD值的平均值,經(jīng)t檢驗(yàn)差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,提示p166的抗原性強(qiáng)于其他4種蛋白。三. p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫血清的HEV中和作用本實(shí)驗(yàn)采用基于PCR的HEV體外中和試驗(yàn),來(lái)評(píng)價(jià)p166、p179、pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫小鼠血清的中和活性。結(jié)果如下：A. p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637和PORF2aa430～660的小鼠免疫血清均有中和作用,其中和效價(jià)分別為1：8、1：8、1：80、1：80和1:4.pORF2aa439～660, pORF2aa422～637免疫血清中和效價(jià)最高,pORF2aa430～660免疫血清中和效價(jià)最低。結(jié)論：1.在p179的基礎(chǔ)上進(jìn)行N端和C端的延長(zhǎng),能夠獲得包含更多抗原表位的、具有良好可溶性的、并可以二聚體形式出現(xiàn)的HEV pORF2截短蛋白；2.新的截短蛋白pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p166、p179進(jìn)行比較發(fā)現(xiàn),5種蛋白均具有良好的免疫原性和抗原性,pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637、pORF2aa430～660免疫原性優(yōu)于p166和p179,而p166的抗原性優(yōu)于pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660和p179；3. pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660誘導(dǎo)產(chǎn)生的免疫血清均具有中和活性,但pORF2aa430～660片段的免疫血清中和效價(jià)最低,pORF2aa439～660、 pORF2aa422～637免疫血清中中和抗體的效價(jià)較高,該兩截短蛋白有可能作為戊型肝炎重組疫苗的候選片段,值得深入研究。
【關(guān)鍵詞】：戊型肝炎病毒 疫苗 重組蛋白 免疫原性 抗原性
【學(xué)位授予單位】：東南大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R512.6
【目錄】：

• 中文摘要5-9
• Abstract9-16
• 符號(hào)、變量、縮略詞等本論文專用術(shù)語(yǔ)的注釋表16-18
• 文獻(xiàn)綜述18-25
• 第1章 HEV ORF2截短蛋白的大腸桿菌表達(dá)、純化及特性分析25-40
• 1.1 前言25
• 1.2 材料與方法25-35
• 1.2.1 主要材料、試劑和儀器25-29
• 1.2.2 實(shí)驗(yàn)方法29-35
• 1.3 結(jié)果35-38
• 1.3.1 目的基因擴(kuò)增35
• 1.3.2 重組質(zhì)粒的構(gòu)建與鑒定35-36
• 1.3.3 重組蛋白的誘導(dǎo)表達(dá)36
• 1.3.4 重組蛋白的可溶性分析36-37
• 1.3.5 重組蛋白的結(jié)構(gòu)分析37
• 1.3.6 重組蛋白的純化及定量37-38
• 1.4 討論38-39
• 1.5 小結(jié)39-40
• 第2章 HEV截短蛋白p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660抗原性和免疫原性研究40-67
• 2.1 前言40
• 2.2 材料和方法40-43
• 2.2.1 主要材料、試劑和儀器40-42
• 2.2.2 實(shí)驗(yàn)方法42-43
• 2.3 結(jié)果43-65
• 2.3.1 小鼠免疫血清抗HEV特異性IgG抗體水平比較43-65
• 2.3.2 基于生物信息學(xué)對(duì)五種蛋白抗原表位的分析65
• 2.4 討論65-66
• 2.5 小結(jié)66-67
• 第3章 HEV截短蛋白p166、p179、pORF2aa439～660、pORF2aa422～637、pORF2aa430～660在體外中和活性的研究67-75
• 3.1 前言67
• 3.2 材料與方法67-72
• 3.2.1 主要材料、試劑和儀器67-70
• 3.2.2 實(shí)驗(yàn)方法70-72
• 3.3 結(jié)果72-73
• 3.3.1 一步法RT-PCR體外中和活性的鑒定72-73
• 3.4 討論73
• 3.5 小結(jié)73-75
• 參考文獻(xiàn)75-84
• 致謝84-85
• 作者簡(jiǎn)介85

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：860547