本文關鍵詞：采用新一代測序技術分析不同感染階段乙型肝炎病毒準種異質性及其臨床意義

  更多相關文章： 肝炎病毒 乙型 準種 Illumina Miseq PCR-克隆-測序 遺傳異質性 突變率指數

【摘要】：背景與目的本課題組之前采用克隆測序(CBS)的方法研究發(fā)現(xiàn)乙型肝炎病毒(HBV)逆轉錄酶區(qū)(RT區(qū))準種異質性可作為接受核苷類似物治療患者抗病毒療效的一個預測指標。近年來,第二代測序技術(NGS)以其相對快速、超深度、高靈敏度的特點給HBV準種研究帶來了新的策略。目前對于HBV感染后不同臨床階段的病毒全長準種異質性的研究還未見報道。本研究應用CBS及NGS方法擴增并獲得急性乙型肝炎(AHB)、慢性HBV攜帶(IT)、慢性乙型肝炎(CHB)、慢加急性乙型肝炎伴肝衰竭(ACLF)、代償期肝硬化(LC)患者血清病毒全長序列,結合生物信息學分析方法描述準種遺傳異質性特征及探討其臨床意義,以期更好的闡述HBV自然史及致病機制。研究對象與方法本研究共納入97名HBV感染的患者(AHB、IT、CHB、ACLF、LC)。40例應用CBS方法、87例應用NGS方法(30例同時應用兩種方法)獲得HBV全長基因組的準種后,通過生物信息學方法對準種的異質性(復雜度和離散度)特征進行分析,并建立了NGS大數據初篩流程和質控方法,最后分析五種不同感染階段的病毒準種異質性、氨基酸突變指數、單個核苷酸復雜度、CP/Pre C核苷酸突變率的特點及其與臨床病程演變的相關性。結果第一部分:40例HBV感染患者,采用CBS方法,平均每名患者獲得14-17株HBV全長克隆,急性HBV感染的準種復雜度較慢性HBV感染的準種復雜度低;慢性HBV感染免疫耐受期準種復雜度低于免疫清除期;不同的免疫壓力下Core區(qū)aa60-130及X區(qū)aa131-135氨基酸變異指數(MFI)有統(tǒng)計學差異,ACLF在這些區(qū)域氨基酸突變指數大于IT及AHB,CHB次之。高突變位點集中在Core區(qū)T、B細胞表位。第二部分:87例HBV感染患者,采用Illumina Miseq高通量測序獲得30G數據,經過數據初篩獲得可分析數據20G,約12 000 000條序列進入最終分析階段。在建立高通量測序的大數據篩選流程的基礎上,對于高通量數據進行篩選(步驟包括:測序質量、測序長度、序列比對優(yōu)化、PCR錯誤糾正優(yōu)化、內參質控評價)和生物信息學分析,每個區(qū)段豐度(除P3外)中位數為6 000(1 500-20000)。在五種不同感染階段中,IT的復雜度(Sn)和平均遺傳距離(d)最低,其次為CHB和AHB,ACLF與LC的Sn和d最高。準種的Sn和d在CHB患者中與高谷丙轉氨酶(5×ULN)、與總膽紅素(1×ULN)血癥、與ACLF預后無關。BCP/Pre C區(qū)核苷酸的分析發(fā)現(xiàn):ACLF和LC患者在CP區(qū)A1762T、G1764A、A1846T/C的變異率達到50%-90%,高于其他組(P0.001)。T1800C在感染B基因型的ACLF患者中變異率最高達46%,而在C基因型中僅有2.4%。未經核苷類似物治療的患者病毒準種耐藥位點突變率在LC組高于其他組(1-4%vs.1%)。CBS與NGS的Sn和d相關性和一致性較差(P0.05)。綜合上述結果發(fā)現(xiàn),AHB準種異質性在CBS研究中為最低,但是在NGS研究中高于IT及CHB準種異質性。慢性感染患者的HBV準種復雜度與免疫壓力和感染時間有關,即免疫壓力越大(ACLF),感染時間越長(LC),復雜度越高,B細胞表位對應的氨基酸突變率(HBc Ag)越高。IT患者三年的HBV準種變化的主要發(fā)生在HBs Ag/RT區(qū)域,表現(xiàn)為突變的積累。結論本研究建立了Illumina Miseq高通量測序研究HBV準種的大數據篩選流程和質控分析方法,發(fā)現(xiàn)在低豐度變異的檢測和準種模擬方面,Illumina Miseq描述準種異質性的表現(xiàn)力較CBS方法更敏感、準確和高效。對HBV準種異質性的分析可以間接反映機體免疫系統(tǒng)對病毒的應答狀態(tài)及感染時間的長短,從而為臨床個體化抗病毒治療提供科學依據。
【關鍵詞】：肝炎病毒 乙型 準種 Illumina Miseq PCR-克隆-測序 遺傳異質性 突變率指數
【學位授予單位】：上海交通大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要5-7
• abstract7-9
• 縮寫/符號說明9-12
• 緒論12-15
• 第一部分 采用PCR-克隆-測序（CBS）方法分析不同感染階段HBV全長準種異質性及其臨床意義15-51
• 引言16-21
• 研究對象與方法21-35
• 結果35-46
• 討論46-50
• 結論50-51
• 第二部分 采用Illumina Miseq （NGS）方法分析不同感染階段HBV準種異質性及其臨床意義51-113
• 引言52-58
• 研究對象與方法58-76
• 結果76-106
• 討論106-112
• 結論112-113
• 展望113-115
• 參考文獻115-124
• 致謝124-127
• 附錄127-147
• 攻讀學位期間取得的主要成績147-148

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前1條

1 ;慢性乙型肝炎防治指南[J];中華傳染病雜志;2005年06期

，

本文編號：860089