發(fā)布時間：2017-09-13 19:01

  本文關鍵詞：SATB1在肝星狀細胞活化和大鼠肝纖維化形成中作用機制的研究

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【摘要】：[研究背景與目的] 肝星狀細胞活化是肝纖維化的中心環(huán)節(jié)。既往研究表明,TGF-β1和MAPK信號通路的異常激活與肝星狀細胞活化及肝纖維化發(fā)展密切相關。SATB1是一種核基質結合蛋白,調控超過1000種基因的轉錄及表達；其參與介導TGF-β1及MAPK等重要細胞信號轉導通路,并影響細胞增殖、凋亡、遷移等生物學過程。但目前關于SATB1在肝星狀細胞活化及肝纖維化形成中的作用尚無研究報道。因此,我們擬在體外細胞水平研究SATB1對肝星狀細胞活化、增殖、遷移和粘附的影響及其機制,以及在體內動物水平研究SATB1對大鼠肝纖維化形成的影響,探索SATB1在肝星狀細胞活化及肝纖維化形成中的作用及機制。 [方法] 利用硫代乙酰胺建立肝纖維化大鼠模型；免疫組織化學、激光共聚焦、real-time PCR和Western blot檢測正常及纖維化大鼠肝組織中SATB1和a-SMA的表達定位及含量變化。建立大鼠肝星狀細胞活化體內及體外模型,real-timePCR和Western blot檢測SATB1和a-SMA的表達變化。利用siRNA及SATB1真核表達質粒(或SATB1腺病毒表達載體)建立SATB1低表達和過表達肝星狀細胞株(人肝星狀細胞株LX-2和大鼠HSCs)。 Real-time PCR和Western blot法檢測SATB1表達變化對HSCs活化相關因子a-SMA、CTGF、COL1A1、COL3A1的影響。CCK-8及real-time PCR法檢測SATB1表達變化對LX-2細胞增殖能力及cyclin D1、 cyclin El的影響。Transwell細胞遷移小室及細胞粘附實驗檢測SATB1表達變化對LX-2細胞遷移和粘附能力的影響。Real-time PCR和Western blot法初步篩選SATB1可能影響的細胞信號通路,包括：TGF-β1信號通路(TGF-β1, Smad2、 Smad3、 Smad4和Smad7)、 MAPK信號通路(Ras、 Raf-1、 MEK、 ERK、 JNK、 P38)以及轉錄因子(Smad4和Ets-1)。利用信號通路抑制劑ManumycinA (Ras)、 GW5074(Raf-1)、 U0126和PD98059(MEK/ERK)以及Ets-1siRNA處理LX-2細胞(NC和siSATB1-1),進一步驗證SATB1調控CTGF的信號通路。Real-time PCR法檢測Ras GTP酶激活蛋白表達變化,篩選SATB1調控Ras激活的基因。硫代乙酰胺法建立肝纖維化大鼠模型,造模5周后將SATB1重組腺病毒經尾靜脈導入大鼠體內,造模7周后HE、Masson及SiriusRed染色觀察肝組織病理改變及膠原沉積,測定肝功能(ALT和AST)評估肝損傷程度,測定羥輔氨酸評估肝內膠原含量變化；免疫組化、real-time PCR及Western blot法檢測a-SMA、CTGF、 COLlA1的表達定位及含量變化。 [結果] SATB1在肝星狀細胞中表達并定位于細胞核；在肝星狀細胞體內及體外活化過程中,隨著肝星狀細胞活化程度的增加,其表達下降(p0.05)。抑制SATB1表達可上調HSCs活化相關基因a-SMA、 CTGF、 COLlAl (p0.05),促進LX-2細胞增殖并上調cyclinE1,以及促進LX-2細胞遷移(p0.05)。反之,增強SATB1表達則發(fā)揮與上述相反的作用(p0.05)。SATB1表達變化對LX-2細胞粘附能力無明顯影響(p0.05)。抑制SATB1表達,對TGF-β1信號通路中TGF-β1、 Smad2、 Smad3、 Smad4及Smad7的mRNA水平,以及Smad3磷酸化和Smad4核轉位無明顯影響；但可激活Ras,繼而誘導Raf-1向胞膜聚集,提高MEK、ERK以及Ets-1磷酸化水平。反之,增強SATB1表達則顯著抑制Ras/Raf/MEK/ERK/Ets-1信號通路。此外,用Ras、 Raf-1、 MEK、 ERK通路蛋白抑制劑和Ets-1siRNA處理LX-2-siSATB1-1細胞,可有效抑制過度激活的Ras、Raf-1、 MEK、 ERK、 Ets-1,從而減弱或消除由SATB1下調所引起的CTGF表達上調。在動物實驗中,與PBS組和AdGFP導入組相比,AdSATB1導入組大鼠肝組織中纖維間隔及匯管區(qū)內膠原沉積明顯減少,羥輔氨酸含量降低,肝功能有所改善,α-SMA、 CTGF和COLlA1的表達水平不同程度下降(p0.05)。 [結論] 在活化的肝星狀細胞中,SATB1表達水平下降；SATB1下調后激活Ras/Raf/MEK/EKR/Ets-1信號通路,誘導促纖維化因子CTGF、 HSCs活化標志性蛋白a-SMA和Ⅰ型膠原(COLlA1)的表達上調,并促進HSCs增殖及遷移。在肝纖維化大鼠模型內,過表達SATB1可改善肝功能、減少肝內膠原沉積及下調a-SMA, CTGF和COL1A1的表達。體內外實驗研究表明：SATB1抑制肝星狀細胞活化及阻礙肝纖維化進程,這為研究肝纖維化發(fā)生發(fā)展的機制提供一個新的思路。
【關鍵詞】：肝纖維化 肝星狀細胞 活化 增殖 遷移 SATB1 Ras信號通路
【學位授予單位】：華中科技大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要8-11
• ABSTRACT11-14
• 前言14-17
• 第一部分 SATB1與肝纖維化及肝星狀細胞活化的相關性研究17-48
• 摘要17-18
• 前言18-19
• 材料和方法19-36
• 結果36-39
• 討論39-42
• 附圖42-48
• 第二部分 SATB1參與肝星狀細胞活化過程的研究48-75
• 中文摘要48-49
• 前言49-50
• 材料與方法50-61
• 結果61-64
• 討論64-67
• 附圖67-75
• 第三部分 SATB1調控促纖維化因子CTGF的信號轉導機制75-96
• 中文摘要75-76
• 前言76-77
• 材料和方法77-82
• 結果82-84
• 討論84-87
• 附圖87-96
• 第四部分 腺病毒介導的SATB1表達對肝纖維化大鼠的影響96-114
• 中文摘要96-97
• 前言97
• 材料和方法97-104
• 結果104-107
• 討論107-110
• 附圖110-114
• 全文總結114-116
• 參考文獻116-127
• 綜述127-144
• 參考文獻137-144
• 英文縮略詞表144-146
• 博士期間發(fā)表的文章146-147
• 致謝147

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本文編號：845322