發(fā)布時(shí)間：2017-09-12 13:04

  本文關(guān)鍵詞：肝臟脂質(zhì)代謝障礙中SIRT6相關(guān)分子的組學(xué)研究

  更多相關(guān)文章： SIRT6 蛋白組學(xué) NAFLD 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 脂代謝

【摘要】：背景:研究發(fā)現(xiàn)Sir2蛋白能夠通過卡路里限制的途徑延長線蟲等低等生物的壽命,這一過程主要是通過Sir2蛋白的去乙�；饔脤�(shí)現(xiàn)的。哺乳動(dòng)物中和Sir2蛋白同源的Sirtuins家族也是一組具有去乙�；钚缘牡鞍住Ｆ浼易宄蓡T之一SIRT6,通過去乙�；饔迷谏頎顟B(tài)下可促進(jìn)機(jī)體維持正常的染色體結(jié)構(gòu)與功能,并以此來調(diào)節(jié)糖脂代謝、抗衰老等。然而,利用組學(xué)研究大規(guī)模篩選SIRT6相關(guān)分子在肝臟糖脂代謝調(diào)節(jié)中的作用目前研究甚少。本課題重點(diǎn)在于通過蛋白組學(xué)挖掘SIRT6相互作用分子及轉(zhuǎn)錄組學(xué)篩選受其調(diào)控的下游分子,來探究受SIRT6影響的哪些分子在調(diào)控肝臟糖脂代謝過程中發(fā)揮顯著作用,以及其發(fā)揮作用的具體機(jī)制,從而為解釋非酒精性脂肪性肝病的發(fā)生發(fā)展提供新的觀點(diǎn)和科學(xué)依據(jù)。目的:1.建立SIRT6高低表達(dá)的L02細(xì)胞系及構(gòu)建SIRT6肝臟特異性敲除小鼠模型。2.SIRT6相互作用分子篩選及鑒定。3.篩選SIRT6調(diào)控的差異表達(dá)基因。方法:1.利用慢病毒轉(zhuǎn)染構(gòu)建L-02 SIRT6-Flag細(xì)胞系;利用TALEN敲除系統(tǒng)構(gòu)建L-02 SIRT6-KO細(xì)胞系;通過油紅O染色、高內(nèi)涵熒光染色實(shí)驗(yàn)觀察L-02SIRT6-KO細(xì)胞成脂能力;通過基因敲除技術(shù)Cre-loxp系統(tǒng),構(gòu)建SIRT6肝臟特異性敲除小鼠;通過DNA瓊脂糖凝膠電泳、Western-Blot鑒定小鼠基因型;建立小鼠NAFLD模型,利用小鼠肝臟HE染色來觀察小鼠肝臟脂肪變的程度,通過免疫組化實(shí)驗(yàn)來驗(yàn)證受SIRT6調(diào)控的下游相關(guān)分子的表達(dá)水平。2.通過免疫共沉淀技術(shù)對(duì)SIRT6的相互作用分子進(jìn)行富集;利用Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù)對(duì)富集分子進(jìn)行篩選和鑒定;通過生物信息學(xué)分析,建立SIRT6相關(guān)作用分子調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。3.利用高通量基因芯片技術(shù)進(jìn)行差異轉(zhuǎn)錄基因篩選;通過q RT-PCR及Western-Blot來對(duì)差異轉(zhuǎn)錄分子進(jìn)行驗(yàn)證,利用i TRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選差異表達(dá)蛋白,利用GO及KEEG對(duì)差異轉(zhuǎn)錄基因及蛋白進(jìn)行信號(hào)通路分析。結(jié)果:1.成功建立L-02 SIRT6-Flag細(xì)胞系及L-02 SIRT6-KO細(xì)胞系;細(xì)胞成脂能力實(shí)驗(yàn)顯示,L-02 SIRT6-KO細(xì)胞系其脂滴形成能力高于對(duì)照組,高內(nèi)涵熒光檢測系統(tǒng)發(fā)現(xiàn)L-02 SIRT6-KO細(xì)胞其脂滴熒光強(qiáng)度高于對(duì)照組。利用Alb-Cre小鼠成功建立肝臟SIRT6特異性敲除小鼠。2.通過免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)及Label-free蛋白質(zhì)組學(xué)非標(biāo)記定量技術(shù),篩選到一組可能和SIRT6發(fā)生相互作用的相關(guān)分子;利用免疫共沉淀技術(shù)進(jìn)行相互作用分子驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)GFAT1等分子很可能是SIRT6相關(guān)作用分子。3.利用基因芯片技術(shù)篩選到一組差異基因,并進(jìn)行q RT-PCR以及Western-Blot驗(yàn)證;發(fā)現(xiàn)STEAP4、CEBPA、KYNU、PDE1A、HMGA2等和糖脂代謝相關(guān)分子。利用i TRAQ蛋白質(zhì)定量技術(shù)篩選差異表達(dá)蛋白,兩者聯(lián)合分析結(jié)論:1.首次建立人肝臟SIRT6穩(wěn)定敲除細(xì)胞系,并經(jīng)功能實(shí)驗(yàn)實(shí)驗(yàn)證明SIRT6缺失能夠促進(jìn)脂滴形成。肝臟SIRT6特異性敲除小鼠的建立為研究SIRT6相關(guān)的脂質(zhì)代謝提供NAFLD模型。2.發(fā)現(xiàn)一組SIRT6相互作用分子如G3BP1、GFAT1、COASY、PARP1等,不僅發(fā)現(xiàn)前人報(bào)導(dǎo)的SIRT6相互作用分子如G3BP1,而且發(fā)現(xiàn)了一批新的分子如GFAT1、COASY.3.篩選到一組和SIRT6相關(guān)參與脂質(zhì)代謝的關(guān)鍵基因。發(fā)現(xiàn)其參與多條與SIRT6相關(guān)的信號(hào)通路。
【關(guān)鍵詞】：SIRT6 蛋白組學(xué) NAFLD 轉(zhuǎn)錄組學(xué) 脂代謝
【學(xué)位授予單位】：第四軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R575.5
【目錄】：

• 縮略語表5-7
• 中文摘要7-10
• 英文摘要10-13
• 前言13-15
• 文獻(xiàn)回顧15-22
• 第一部分 建立SIRT6高低表達(dá)的L02細(xì)胞系及構(gòu)建SIRT6肝臟特異性敲除小鼠模型22-36
• 1 材料22-23
• 2 方法23-30
• 3 結(jié)果30-35
• 4 討論35-36
• 第二部分 SIRT6相互蛋白分子的篩選與鑒定36-48
• 1 材料36
• 2 方法36-39
• 3 結(jié)果39-46
• 4 討論46-48
• 第三部分 SIRT6相關(guān)的差異表達(dá)基因的篩選48-55
• 1 材料48
• 2 方法48-50
• 3 結(jié)果50-53
• 4 討論53-55
• 小結(jié)55-56
• 參考文獻(xiàn)56-61
• 附錄61-66
• 個(gè)人簡歷和研究成果66-67
• 致謝67

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1 呂子全;郭非凡;;氨基酸感應(yīng)與糖脂代謝調(diào)控的研究進(jìn)展[J];生命科學(xué);2013年02期

2 陳雯;唐煒立;周智廣;;成纖維細(xì)胞生長因子21的糖脂代謝調(diào)節(jié)功能研究進(jìn)展[J];中南醫(yī)學(xué)科學(xué)雜志;2013年02期

3 吳紅衛(wèi);鄭景晨;;脂聯(lián)素與糖脂代謝[J];實(shí)用全科醫(yī)學(xué);2007年06期

4 郭慧;李駿;江鐘立;;體力活動(dòng)的增加對(duì)2型糖尿病患者糖脂代謝和醫(yī)藥費(fèi)用影響的隨訪觀察[J];中國康復(fù)醫(yī)學(xué)雜志;2007年05期

5 周s，

本文編號(hào)：837366