本文關(guān)鍵詞：肝再生增強(qiáng)因子對刀豆蛋白A誘導(dǎo)的小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用研究

  更多相關(guān)文章： 肝再生增強(qiáng)因子 免疫調(diào)節(jié) 基因治療 刀豆蛋白A

【摘要】：肝臟是人體最大的消化器官。由于消化功能的需要,肝臟持續(xù)的接收來自胃腸道的血液,這些血液中含有大量的外來抗原。為了抵御外來抗原,肝臟內(nèi)網(wǎng)狀的肝血竇周圍含有大量的免疫細(xì)胞,存在復(fù)雜的免疫反應(yīng)。為了保護(hù)自身細(xì)胞不被過激的免疫反應(yīng)所傷害,肝臟處于免疫排斥和免疫耐受的平衡狀態(tài)。病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展均與肝臟免疫失衡有關(guān)。研究肝臟中的免疫調(diào)節(jié)物質(zhì)對肝臟疾病的預(yù)防及治療都具有非常重要的意義。肝再生增強(qiáng)因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一種具有熱穩(wěn)定性,無種屬特異性的小分子蛋白。先前ALR的研究主要集中在促進(jìn)肝細(xì)胞再生、抑制細(xì)胞凋亡和促進(jìn)線粒體基因表達(dá)等方面。外源性給予重組ALR蛋白能夠改善藥物性肝損傷、肝硬化和實(shí)驗(yàn)性肝纖維化大鼠肝臟功能。在多種毒物誘導(dǎo)的肝損傷動物模型中,ALR可促進(jìn)肝細(xì)胞再生,減輕急性肝損傷,改善肝功能,增加動物存活時間和提高動物存活率。近來,研究發(fā)現(xiàn)ALR能夠抑制T細(xì)胞、NK細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞的增殖和激活,具有免疫調(diào)節(jié)作用。由于重組ALR蛋白的穩(wěn)定性差、生物利用度低等原因,體內(nèi)研究較少,其發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)的作用機(jī)制尚不明確�；蛑委煹姆椒◤浹a(bǔ)了重組蛋白的不足。本文通過基因治療的方法研究ALR對刀豆蛋白A (Concanavalin A, Con A)誘導(dǎo)小鼠免疫性肝損傷的保護(hù)作用,對ALR的免疫調(diào)節(jié)功能進(jìn)行了研究。本實(shí)驗(yàn)室先前已經(jīng)成功的構(gòu)建hALR重組質(zhì)粒與微環(huán),并應(yīng)用于肝纖維化治療研究。本研究在此基礎(chǔ)上,大量的制備了hALR的重組微環(huán)。ALR重組微環(huán)通過水動力轉(zhuǎn)染,顯著地提高小鼠肝臟內(nèi)ALR的表達(dá)。在30 mg/kg Con A誘導(dǎo)的重度免疫性肝損傷動物模型中,經(jīng)過ALR微環(huán)轉(zhuǎn)染后小鼠的存活時間與存活率相比Con A造模組有顯著增加。在15mg/kg Con A誘導(dǎo)的輕度免疫性肝損傷動物模型中,ALR組小鼠血清的谷丙轉(zhuǎn)氨酶與谷草轉(zhuǎn)氨酶相比Con A造模組有顯著的降低。與Con A造模組相比,ALR組中血清的TNF-a和IL-6蛋白水平有顯著的降低,但I(xiàn)FN-γ沒有明顯變化。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明ALR在肝臟中表達(dá)的增加可以減輕Con A誘發(fā)的免疫性肝損傷,對免疫性肝損傷的小鼠具有保護(hù)作用。因此,我們對ALR的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制做進(jìn)一步研究。通過熒光實(shí)時定量PCR檢測,ALR組小鼠肝臟內(nèi)的炎性因子TNF-a mRNA和IL-6 mRNA顯著的低于ConA造模組,IFN-γ mRNA則沒有顯著差異。該結(jié)果與先前的血清蛋白檢測結(jié)果一致,證實(shí)ALR在Con A誘導(dǎo)的肝炎中可以降低TNF-α和IL-6的表達(dá),但不能抑制IFN-γ。隨后又對肝臟中iNOS mRNA、趨化因子CXCL-10 mRNA和CCL-3 mRNA進(jìn)行檢查,相比Con A造模組,ALR能夠降低iNOS、趨化因子CXCL-10和CCL-3的表達(dá)。流式細(xì)胞術(shù)檢測結(jié)果顯示ALR組小鼠肝臟內(nèi)淋巴細(xì)胞的比例、CD4和CD8 T細(xì)胞的陽性率顯著的低于Con A造模組。該結(jié)果說明ALR抑制了T淋巴細(xì)胞在肝組織中的浸潤與激活。此外,Western免疫印跡結(jié)果顯示,ALR組小鼠肝臟中NF-xB p65和 IxBa蛋白磷酸化的比例顯著低于Con A造模組,說明ALR抑制了NF-xB信號通路活化。相比Con A造模組,ALR組小鼠肝臟中磷酸化的JNK和p38-MAPK也有顯著的下調(diào),說明ALR對JNK與MAPK信號通路也存在抑制作用。以上結(jié)果表明ALR通過抑制炎性細(xì)胞因子、趨化因子、T淋巴細(xì)胞和多條信號通路減輕了Con A誘導(dǎo)的免疫性肝損傷,證實(shí)ALR具有免疫調(diào)節(jié)作用。
【關(guān)鍵詞】：肝再生增強(qiáng)因子 免疫調(diào)節(jié) 基因治療 刀豆蛋白A
【學(xué)位授予單位】：沈陽藥科大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 縮略詞表14-16
• 第一章 前言16-21
• 1.1 肝臟與免疫16-17
• 1.2 肝臟的免疫耐受17-18
• 1.3 ALR與免疫18-19
• 1.4 基因治療19-20
• 1.5 研究的意義20-21
• 第二章 ALR微環(huán)載體的制備及表達(dá)21-34
• 2.1 實(shí)驗(yàn)材料21-23
• 2.1.1 工程菌與實(shí)驗(yàn)動物21
• 2.1.2 主要試劑21-22
• 2.1.3 試劑盒22
• 2.1.4 培養(yǎng)基及溶液22-23
• 2.1.5 主要儀器23
• 2.2 實(shí)驗(yàn)方法23-29
• 2.2.1 ALR微環(huán)真核表達(dá)載體的大量制備23-25
• 2.2.2 ALR微環(huán)真核表達(dá)載體的酶切鑒定25
• 2.2.3 水動力轉(zhuǎn)染25
• 2.2.4 ALR表達(dá)的檢測25-29
• 2.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果29-30
• 2.3.1 ALR微環(huán)真核表達(dá)載體的酶切鑒定結(jié)果29-30
• 2.3.2 ALR水動力轉(zhuǎn)染的表達(dá)結(jié)果30
• 2.4 討論30-34
• 第三章 免疫性肝損傷動物模型的建立34-40
• 3.1 實(shí)驗(yàn)材料34
• 3.1.1 實(shí)驗(yàn)動物34
• 3.1.2 試劑及試劑盒34
• 3.2 實(shí)驗(yàn)方法34-37
• 3.2.1 Con A誘導(dǎo)小鼠產(chǎn)生免疫性肝炎34-35
• 3.2.2 采集血液標(biāo)本和動物觀察35
• 3.2.3 測定血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)35
• 3.2.4 測定血清炎性因子(TNF-α,IL-6,IFN-γ)35-37
• 3.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果37-38
• 3.3.1 小鼠一般狀態(tài)37
• 3.3.2 血清轉(zhuǎn)氨酶的測定結(jié)果37-38
• 3.3.3 血清炎性因子的測定結(jié)果38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 ALR對免疫性肝損傷的保護(hù)作用40-59
• 4.1 實(shí)驗(yàn)材料40-42
• 4.1.1 實(shí)驗(yàn)動物與工程菌40
• 4.1.2 主要試劑與試劑盒40-41
• 4.1.3 引物41-42
• 4.1.4 主要儀器42
• 4.2 實(shí)驗(yàn)方法42-47
• 4.2.1 微環(huán)DNA大量提取42
• 4.2.2 實(shí)驗(yàn)動物ALR轉(zhuǎn)染和Con A誘導(dǎo)造模42-43
• 4.2.3 血清轉(zhuǎn)氨酶(ALT、AST)含量測定43
• 4.2.4 血清促炎性細(xì)胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)含量測定43
• 4.2.5 肝臟RNA分析43-45
• 4.2.6 肝臟蛋白Western blot分析45
• 4.2.7 肝臟淋巴細(xì)胞的分離45-46
• 4.2.8 流式細(xì)胞分析46-47
• 4.2.9 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法47
• 4.3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-55
• 4.3.1 轉(zhuǎn)染過程中動物的一般狀態(tài)47
• 4.3.2 高劑量Con A存活實(shí)驗(yàn)結(jié)果47-48
• 4.3.3 肝臟中ALR的測定結(jié)果48
• 4.3.4 血清轉(zhuǎn)氨酶的測定結(jié)果48-49
• 4.3.5 血清中促炎性細(xì)胞因子的測定結(jié)果49-50
• 4.3.6 肝臟中促炎性細(xì)胞因子mRNA的測定結(jié)果50
• 4.3.7 ALR對肝臟趨化因子的影響50-51
• 4.3.8 ALR對肝臟淋巴細(xì)胞分型的影響51-53
• 4.3.9 ALR對肝臟中NF-κB信號通路的影響53
• 4.3.10 ALR對肝臟中JNK和MAPK信號通路的影響53-54
• 4.3.11 肝臟中iNOS的變化54-55
• 4.4 討論55-59
• 4.4.1 ALR對炎性細(xì)胞因子和iNOS的影響55-56
• 4.4.2 ALR對T淋巴細(xì)胞分型的影響56
• 4.4.3 ALR對趨化因子的影響56-57
• 4.4.4 ALR對NF-κB信號通路的影響57
• 4.4.5 ALR對JNK和p38 MAPK的影響57-59
• 參考文獻(xiàn)59-66
• 全文總結(jié)66-67
• 論文發(fā)表情況67-68
• 致謝68-69
• 附件69-76
• 學(xué)位論文自愿預(yù)先檢測申請表76

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：796091