本文關鍵詞：肝再生增強因子對刀豆蛋白A誘導的小鼠免疫性肝損傷的保護作用研究

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【摘要】：肝臟是人體最大的消化器官。由于消化功能的需要,肝臟持續(xù)的接收來自胃腸道的血液,這些血液中含有大量的外來抗原。為了抵御外來抗原,肝臟內網(wǎng)狀的肝血竇周圍含有大量的免疫細胞,存在復雜的免疫反應。為了保護自身細胞不被過激的免疫反應所傷害,肝臟處于免疫排斥和免疫耐受的平衡狀態(tài)。病毒性肝炎、自身免疫性肝炎等多種肝臟疾病的發(fā)生與發(fā)展均與肝臟免疫失衡有關。研究肝臟中的免疫調節(jié)物質對肝臟疾病的預防及治療都具有非常重要的意義。肝再生增強因子(Augmenter of liver regeneration, ALR)是一種具有熱穩(wěn)定性,無種屬特異性的小分子蛋白。先前ALR的研究主要集中在促進肝細胞再生、抑制細胞凋亡和促進線粒體基因表達等方面。外源性給予重組ALR蛋白能夠改善藥物性肝損傷、肝硬化和實驗性肝纖維化大鼠肝臟功能。在多種毒物誘導的肝損傷動物模型中,ALR可促進肝細胞再生,減輕急性肝損傷,改善肝功能,增加動物存活時間和提高動物存活率。近來,研究發(fā)現(xiàn)ALR能夠抑制T細胞、NK細胞等多種免疫細胞的增殖和激活,具有免疫調節(jié)作用。由于重組ALR蛋白的穩(wěn)定性差、生物利用度低等原因,體內研究較少,其發(fā)揮免疫調節(jié)的作用機制尚不明確。基因治療的方法彌補了重組蛋白的不足。本文通過基因治療的方法研究ALR對刀豆蛋白A (Concanavalin A, Con A)誘導小鼠免疫性肝損傷的保護作用,對ALR的免疫調節(jié)功能進行了研究。本實驗室先前已經成功的構建hALR重組質粒與微環(huán),并應用于肝纖維化治療研究。本研究在此基礎上,大量的制備了hALR的重組微環(huán)。ALR重組微環(huán)通過水動力轉染,顯著地提高小鼠肝臟內ALR的表達。在30 mg/kg Con A誘導的重度免疫性肝損傷動物模型中,經過ALR微環(huán)轉染后小鼠的存活時間與存活率相比Con A造模組有顯著增加。在15mg/kg Con A誘導的輕度免疫性肝損傷動物模型中,ALR組小鼠血清的谷丙轉氨酶與谷草轉氨酶相比Con A造模組有顯著的降低。與Con A造模組相比,ALR組中血清的TNF-a和IL-6蛋白水平有顯著的降低,但IFN-γ沒有明顯變化。上述實驗結果表明ALR在肝臟中表達的增加可以減輕Con A誘發(fā)的免疫性肝損傷,對免疫性肝損傷的小鼠具有保護作用。因此,我們對ALR的免疫調節(jié)機制做進一步研究。通過熒光實時定量PCR檢測,ALR組小鼠肝臟內的炎性因子TNF-a mRNA和IL-6 mRNA顯著的低于ConA造模組,IFN-γ mRNA則沒有顯著差異。該結果與先前的血清蛋白檢測結果一致,證實ALR在Con A誘導的肝炎中可以降低TNF-α和IL-6的表達,但不能抑制IFN-γ。隨后又對肝臟中iNOS mRNA、趨化因子CXCL-10 mRNA和CCL-3 mRNA進行檢查,相比Con A造模組,ALR能夠降低iNOS、趨化因子CXCL-10和CCL-3的表達。流式細胞術檢測結果顯示ALR組小鼠肝臟內淋巴細胞的比例、CD4和CD8 T細胞的陽性率顯著的低于Con A造模組。該結果說明ALR抑制了T淋巴細胞在肝組織中的浸潤與激活。此外,Western免疫印跡結果顯示,ALR組小鼠肝臟中NF-xB p65和 IxBa蛋白磷酸化的比例顯著低于Con A造模組,說明ALR抑制了NF-xB信號通路活化。相比Con A造模組,ALR組小鼠肝臟中磷酸化的JNK和p38-MAPK也有顯著的下調,說明ALR對JNK與MAPK信號通路也存在抑制作用。以上結果表明ALR通過抑制炎性細胞因子、趨化因子、T淋巴細胞和多條信號通路減輕了Con A誘導的免疫性肝損傷,證實ALR具有免疫調節(jié)作用。
【關鍵詞】：肝再生增強因子 免疫調節(jié) 基因治療 刀豆蛋白A
【學位授予單位】：沈陽藥科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 摘要10-12
• Abstract12-14
• 縮略詞表14-16
• 第一章 前言16-21
• 1.1 肝臟與免疫16-17
• 1.2 肝臟的免疫耐受17-18
• 1.3 ALR與免疫18-19
• 1.4 基因治療19-20
• 1.5 研究的意義20-21
• 第二章 ALR微環(huán)載體的制備及表達21-34
• 2.1 實驗材料21-23
• 2.1.1 工程菌與實驗動物21
• 2.1.2 主要試劑21-22
• 2.1.3 試劑盒22
• 2.1.4 培養(yǎng)基及溶液22-23
• 2.1.5 主要儀器23
• 2.2 實驗方法23-29
• 2.2.1 ALR微環(huán)真核表達載體的大量制備23-25
• 2.2.2 ALR微環(huán)真核表達載體的酶切鑒定25
• 2.2.3 水動力轉染25
• 2.2.4 ALR表達的檢測25-29
• 2.3 實驗結果29-30
• 2.3.1 ALR微環(huán)真核表達載體的酶切鑒定結果29-30
• 2.3.2 ALR水動力轉染的表達結果30
• 2.4 討論30-34
• 第三章 免疫性肝損傷動物模型的建立34-40
• 3.1 實驗材料34
• 3.1.1 實驗動物34
• 3.1.2 試劑及試劑盒34
• 3.2 實驗方法34-37
• 3.2.1 Con A誘導小鼠產生免疫性肝炎34-35
• 3.2.2 采集血液標本和動物觀察35
• 3.2.3 測定血清轉氨酶(ALT、AST)35
• 3.2.4 測定血清炎性因子(TNF-α,IL-6,IFN-γ)35-37
• 3.3 實驗結果37-38
• 3.3.1 小鼠一般狀態(tài)37
• 3.3.2 血清轉氨酶的測定結果37-38
• 3.3.3 血清炎性因子的測定結果38
• 3.4 討論38-40
• 第四章 ALR對免疫性肝損傷的保護作用40-59
• 4.1 實驗材料40-42
• 4.1.1 實驗動物與工程菌40
• 4.1.2 主要試劑與試劑盒40-41
• 4.1.3 引物41-42
• 4.1.4 主要儀器42
• 4.2 實驗方法42-47
• 4.2.1 微環(huán)DNA大量提取42
• 4.2.2 實驗動物ALR轉染和Con A誘導造模42-43
• 4.2.3 血清轉氨酶(ALT、AST)含量測定43
• 4.2.4 血清促炎性細胞因子(TNF-α、IL-6、IFN-γ)含量測定43
• 4.2.5 肝臟RNA分析43-45
• 4.2.6 肝臟蛋白Western blot分析45
• 4.2.7 肝臟淋巴細胞的分離45-46
• 4.2.8 流式細胞分析46-47
• 4.2.9 統(tǒng)計學方法47
• 4.3 實驗結果47-55
• 4.3.1 轉染過程中動物的一般狀態(tài)47
• 4.3.2 高劑量Con A存活實驗結果47-48
• 4.3.3 肝臟中ALR的測定結果48
• 4.3.4 血清轉氨酶的測定結果48-49
• 4.3.5 血清中促炎性細胞因子的測定結果49-50
• 4.3.6 肝臟中促炎性細胞因子mRNA的測定結果50
• 4.3.7 ALR對肝臟趨化因子的影響50-51
• 4.3.8 ALR對肝臟淋巴細胞分型的影響51-53
• 4.3.9 ALR對肝臟中NF-κB信號通路的影響53
• 4.3.10 ALR對肝臟中JNK和MAPK信號通路的影響53-54
• 4.3.11 肝臟中iNOS的變化54-55
• 4.4 討論55-59
• 4.4.1 ALR對炎性細胞因子和iNOS的影響55-56
• 4.4.2 ALR對T淋巴細胞分型的影響56
• 4.4.3 ALR對趨化因子的影響56-57
• 4.4.4 ALR對NF-κB信號通路的影響57
• 4.4.5 ALR對JNK和p38 MAPK的影響57-59
• 參考文獻59-66
• 全文總結66-67
• 論文發(fā)表情況67-68
• 致謝68-69
• 附件69-76
• 學位論文自愿預先檢測申請表76

【參考文獻】

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本文編號：796091