本文關(guān)鍵詞：人羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)工藝及向肝樣細(xì)胞分化的研究

  更多相關(guān)文章： 人羊膜上皮細(xì)胞 培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化 凍存 熒光定量PCR

【摘要】：目的 建立人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與凍存工藝,研究其基本的生物學(xué)特性,并進(jìn)行人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化的研究。方法無菌條件下收集剖宮產(chǎn)新生兒的羊膜,采用正交法對不同的分離、培養(yǎng)與凍存條件設(shè)計適宜的因素水平,采用與之相對應(yīng)的正交表進(jìn)行試驗。以相同質(zhì)量羊膜所得SSEA-4陽性細(xì)胞量為對照,研究胰酶濃度、消化時間與消化次數(shù)等影響因素對分離效果的影響；以SSEA-4陽性細(xì)胞量/細(xì)胞接種量為對照,研究細(xì)胞接種密度、血清濃度與細(xì)胞生長因子EGF濃度等影響因素對培養(yǎng)效果的影響；以復(fù)蘇細(xì)胞存活率為對照,研究細(xì)胞凍存密度、DMSO濃度與血清濃度等影響因素對凍存效果的影響。以此提出優(yōu)化的人羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)與凍存工藝。取原代、傳代及凍存復(fù)蘇細(xì)胞做形態(tài)學(xué)觀察,繪制細(xì)胞生長曲線,對原代細(xì)胞作相關(guān)表面標(biāo)志物的免疫熒光染色,并對原代及P4代細(xì)胞作免疫流式細(xì)胞檢測。取P1代人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化,誘導(dǎo)組在5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液中加入20ng/ml HGF、10ng/ml FGF4、10ng/mlIGF-1、500nM Dex誘導(dǎo)試劑組合,對照組只加入5%FBS的DMEM/F12培養(yǎng)液,誘導(dǎo)周期為三周。鏡下對比誘導(dǎo)細(xì)胞與對照細(xì)胞形態(tài)的變化,誘導(dǎo)過程中細(xì)胞免疫熒光染色的變化,逆轉(zhuǎn)錄與熒光定量PCR檢測誘導(dǎo)過程中肝細(xì)胞相關(guān)基因AFP、ALB、HNF4α與CYP1A2表達(dá)量的變化,并對誘導(dǎo)3周后hAECs細(xì)胞作糖原染色檢測。結(jié)果經(jīng)正交法數(shù)據(jù)分析得到,優(yōu)化的胰酶消化羊膜上皮細(xì)胞的分離條件為：胰酶濃度0.25%,分4次消化,每次消化時間20min,分離因素影響大小依次為：消化次數(shù)消化時間胰酶濃度。優(yōu)化的培養(yǎng)條件為：細(xì)胞接種密度為4x105/ml, EGF濃度為10ng/ml,血清濃度為5%,培養(yǎng)因素影響大小依次為：細(xì)胞接種密度血清濃度EGF濃度。優(yōu)化的凍存條件為：細(xì)胞凍存密度為1×107/ml, DMSO濃度為10%,血清濃度為80%。凍存因素影響大小依次為：DMSO濃度細(xì)胞凍存密度血清濃度。原代接種細(xì)胞2-3d內(nèi)下沉貼壁生長,貼壁后呈扁平不規(guī)則多角形,以鋪路石樣生長。傳代后細(xì)胞貼壁與生長速度加快,凍存復(fù)蘇的P2代細(xì)胞生長與擴(kuò)增能力無明顯下降。免疫熒光染色顯示,原代細(xì)胞強(qiáng)表達(dá)CK19、SSEA-4,不表達(dá)Vimentin、CD45和HLA-DR。統(tǒng)計原代及P4代細(xì)胞流式檢測數(shù)據(jù),P4代細(xì)胞中SSEA-4與CK19免疫陽性細(xì)胞百分率較原代細(xì)胞有顯著減少(P0.0001);而Vimentin和CD105較原代細(xì)胞有顯著增加(P0.0001)；P4代與原代細(xì)胞的CD73免疫陽性細(xì)胞百分率均很高,且無顯著性差異(P=0.1620.05)；HLA-DR在原代或P4代細(xì)胞中均不表達(dá)。人羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)2周后,細(xì)胞由橢圓形逐漸向多角扁平形狀轉(zhuǎn)變,細(xì)胞折光性增加。經(jīng)免疫熒光染色顯示,誘導(dǎo)1周后AFP表達(dá)量大,但3周后有明顯下降；誘導(dǎo)3周的ALB和CK18的表達(dá)量均較1周的有明顯增加；而SSEA-4的表達(dá)量逐漸減弱。熒光定量PCR采用2-Δ△ct法對各基因進(jìn)行相對定量顯示,誘導(dǎo)1周后人羊膜上皮細(xì)胞的AFP相對表達(dá)量顯著大于誘導(dǎo)前(P0.05),誘導(dǎo)3周后,AFP相對表達(dá)量又顯著降低(P0.05)；誘導(dǎo)3周后,ALB、HNF4α和CYP1A2三種基因的相對表達(dá)量均顯著大于誘導(dǎo)前(P值均小于0.05)。結(jié)論建立了人羊膜上皮細(xì)胞分離、培養(yǎng)與凍存的優(yōu)化工藝。人羊膜上皮細(xì)胞易于獲得且體外增殖能力強(qiáng),表達(dá)胚胎干細(xì)胞保持未分化狀態(tài)的表面標(biāo)志物。體外可誘導(dǎo)向肝樣細(xì)胞分化,表達(dá)肝細(xì)胞特異性基因,具備肝細(xì)胞特有功能特征,有望成為干細(xì)胞治療終末期肝病良好的細(xì)胞來源。
【關(guān)鍵詞】：人羊膜上皮細(xì)胞 培養(yǎng) 誘導(dǎo)分化 凍存 熒光定量PCR
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575
【目錄】：

• 致謝4-5
• 中文摘要5-7
• Abstract7-12
• 專業(yè)名詞中英文對照表12-13
• 1 緒論13-20
• 1.1 人羊膜上皮細(xì)胞與肝病13
• 1.2 國內(nèi)外研究現(xiàn)狀13-18
• 1.2.1 人羊膜上皮細(xì)胞的分離13-14
• 1.2.2 人羊膜上皮細(xì)胞的培養(yǎng)14-15
• 1.2.3 人羊膜上皮細(xì)胞的凍存15-16
• 1.2.4 人羊膜上皮細(xì)胞的表面標(biāo)志物16-17
• 1.2.5 人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化17-18
• 1.3 本研究的目的、內(nèi)容與研究方法18-20
• 1.3.1 研究目的18
• 1.3.2 人羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)及凍存工藝的優(yōu)化18-19
• 1.3.3 人羊膜上皮細(xì)胞生物學(xué)特性的研究19
• 1.3.4 誘導(dǎo)人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞分化19-20
• 2 人羊膜上皮細(xì)胞分離培養(yǎng)凍存工藝及其生物學(xué)特性的研究20-40
• 2.1 實驗材料20
• 2.1.1 實驗標(biāo)本及其來源20
• 2.2 主要試劑與儀器設(shè)備20-23
• 2.2.1 實驗試劑20-22
• 2.2.2 實驗器械及儀器設(shè)備22
• 2.2.3 試劑配制22-23
• 2.3 實驗方法23-27
• 2.3.1 實驗標(biāo)本采集23
• 2.3.2 羊膜上皮細(xì)胞分離23-24
• 2.3.3 羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)24
• 2.3.4 羊膜上皮細(xì)胞傳代24
• 2.3.5 羊膜上皮細(xì)胞凍存24-25
• 2.3.6 羊膜上皮細(xì)胞復(fù)蘇25
• 2.3.7 活細(xì)胞計數(shù)25
• 2.3.8 羊膜上皮細(xì)胞生長曲線25-26
• 2.3.9 免疫熒光染色26
• 2.3.10 流式細(xì)胞儀檢測免疫細(xì)胞陽性率26
• 2.3.11 蘇木素-伊紅染色26
• 2.3.12 統(tǒng)計學(xué)分析26-27
• 2.4 實驗結(jié)果27-36
• 2.4.1 羊膜上皮細(xì)胞分離27-28
• 2.4.2 羊膜上皮細(xì)胞培養(yǎng)28-30
• 2.4.3 羊膜上皮細(xì)胞凍存30-32
• 2.4.4 培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)特征32-33
• 2.4.5 蘇木素-伊紅染色33
• 2.4.6 羊膜上皮細(xì)胞生長曲線33-34
• 2.4.7 免疫熒光染色檢測結(jié)果34-35
• 2.4.8 免疫流式細(xì)胞檢測結(jié)果35
• 2.4.9 流式檢測條狀統(tǒng)計圖35-36
• 2.5 討論36-38
• 2.6 結(jié)論38-40
• 3 人羊膜上皮細(xì)胞向肝樣細(xì)胞誘導(dǎo)分化的研究40-54
• 3.1 主要試劑和儀器設(shè)備40-42
• 3.1.1 實驗試劑40-41
• 3.1.2 實驗儀器41-42
• 3.2 實驗方法42-45
• 3.2.1 體外肝細(xì)胞樣細(xì)胞誘導(dǎo)體系的建立42
• 3.2.2 免疫熒光染色42
• 3.2.3 糖原染色42
• 3.2.4 總RNA的抽提42-43
• 3.2.5 總RNA定量與電泳43
• 3.2.6 逆轉(zhuǎn)錄PCR合成cDNA43-44
• 3.2.7 肝細(xì)胞關(guān)鍵基因熒光定量PCR反應(yīng)44-45
• 3.3 實驗結(jié)果45-51
• 3.3.1 羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)組與對照組細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察46
• 3.3.2 羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)后的免疫熒光染色46-48
• 3.3.3 熒光定量RCR檢測誘導(dǎo)過程中羊膜上皮細(xì)胞的肝細(xì)胞特異性基因的表達(dá)48-51
• 3.3.4 羊膜上皮細(xì)胞誘導(dǎo)后的糖原染色51
• 3.4 討論51-53
• 3.5 結(jié)論53-54
• 參考文獻(xiàn)54-59
• 附錄59-65
• 作者簡介65

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