發(fā)布時間：2017-09-01 15:36

  本文關(guān)鍵詞：新型肝炎病毒感染體系構(gòu)建及抗病毒先天免疫應(yīng)答研究

  更多相關(guān)文章： HCV HBV HLCZ01 先天免疫反應(yīng) 細(xì)胞凋亡 ISG12a miR-942

【摘要】：全球有超過5億人口屬于丙型肝炎病毒(HCV)和/或乙型肝炎病毒(HBV)慢性感染人群,這些感染者有可能逐步發(fā)展為慢性肝炎、肝硬化和肝癌。因缺少理想的病毒感染體系而制約了病毒生活周期、先天免疫反應(yīng)以及發(fā)病機(jī)制的相關(guān)研究,從而阻礙了研發(fā)抗病毒藥物的進(jìn)程。盡管乙肝病毒的預(yù)防性疫苗早已上市,HCV疫苗卻還未研發(fā)成功。相比于其它大部分的病毒感染,HCV感染的主要特征是極易形成慢性感染(約80%)。另一方面,約有20%的HCV感染者能夠自動清除體內(nèi)病毒而不需要接受治療,表明宿主的先天免疫反應(yīng)可以控制病毒感染。在病毒感染過程中,誘導(dǎo)I型干擾素和干擾素刺激基因(ISGs)是宿主抵御病毒的主要方式。宿主通過模式識別受體(PRRs)捕獲病毒感染所形成的病原體相關(guān)分子模式(PAMPs),激活先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。主要的PRRs包括RIG-I樣受體(RLRs)、Toll樣受體(TLRs)、Nod樣受體(NLRs)和蛋白激酶R(PKR)。然而,HCV和肝細(xì)胞抗病毒先天免疫反應(yīng)之間的復(fù)雜相互作用機(jī)制未知。本研究工作旨在研發(fā)一個理想的HCV和HBV感染細(xì)胞培養(yǎng)體系,并基于此體系探究宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫機(jī)制。第一,我們成功分離了一株新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。該細(xì)胞系來源于一位患有高分化肝癌的男性病人的肝組織。HLCZ01細(xì)胞的形態(tài)酷似人正常原代肝細(xì)胞(PHH),并表達(dá)多種肝細(xì)胞特異性標(biāo)志物,包括白蛋白(ALB)、α1-抗胰蛋白酶(AAT)、肝細(xì)胞核因子4(HNF4)、細(xì)胞色素CYP3A4和mi R-122。同時,HLCZ01細(xì)胞還表達(dá)HCV的四種受體,分別為CD81、SR-BI、CLDN1和OCLN。第二,HLCZ01細(xì)胞系支持HCV和HBV感染的完整生活周期。HLCZ01細(xì)胞既支持實驗室來源和臨床病人血清中的HCV感染和復(fù)制,又支持體外來源的和體內(nèi)病人血清來源的HBV感染和復(fù)制。從病毒感染的HLCZ01細(xì)胞中組裝和釋放的HBV和HCV可以再感染原始的HLCZ01細(xì)胞。HLCZ01細(xì)胞支持HBV和HCV共感染,并且這兩種肝炎病毒在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制互不干擾�？笻Bs Ag和抗CD81特異性抗體可分別阻斷HBV和HCV入侵HLCZ01細(xì)胞。已開發(fā)的抗病毒藥物可有效抑制HBV和HCV在HLCZ01細(xì)胞中的復(fù)制。HLCZ01是世界首例支持HBV和HCV病人血清直接感染以及HBV/HCV共感染的肝癌細(xì)胞系,這株細(xì)胞系可應(yīng)用于肝炎病毒生活周期、肝細(xì)胞與肝炎病毒相互作用的研究以及抗病毒藥物和疫苗的研發(fā)。第三,HLCZ01細(xì)胞和PHH具有完整的先天免疫應(yīng)答系統(tǒng)。一方面,HCV感染肝細(xì)胞后可誘導(dǎo)IFN-β和G1P3、ISG12a以及1-8U等抗病毒ISGs的表達(dá)。在HLCZ01細(xì)胞中,HBV的存在并不影響HCV誘導(dǎo)IFN-β和ISGs的產(chǎn)生。另一方面,HCV感染HLCZ01細(xì)胞和PHH至相對較長時間點時,可誘導(dǎo)病毒感染細(xì)胞凋亡,這可能是宿主細(xì)胞清除病毒的另一種先天免疫應(yīng)答方式。在肝細(xì)胞中沉默TRAIL可抑制HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。RIG-I缺失可下調(diào)IFN-β和TRAIL的表達(dá),并阻斷病毒誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,從而促進(jìn)病毒復(fù)制。IRF3是RIG-I的下游信號分子,同樣參與了TRAIL介導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡。第四,mi R-942通過調(diào)控ISG12a表達(dá)以介導(dǎo)HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡。借助于HLCZ01細(xì)胞感染體系,找到了介導(dǎo)HCV所致細(xì)胞凋亡的重要調(diào)控分子ISG12a及其參與HCV誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡的信號通路。經(jīng)生物信息學(xué)方法預(yù)測和實驗驗證顯示,mi R-942是ISG12a的負(fù)調(diào)控因子。HCV感染可下調(diào)mi R-942的表達(dá),并且mi R-942與ISG12a在HCV感染的肝細(xì)胞和肝組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性。過表達(dá)或沉默mi R-942可分別減弱或增強(qiáng)HCV誘導(dǎo)的細(xì)胞調(diào)亡。同時,促凋亡蛋白Noxa在HCV感染細(xì)胞中被誘導(dǎo)表達(dá),誘導(dǎo)的Noxa可介導(dǎo)ISG12a依賴的肝細(xì)胞凋亡。綜上所述,本研究工作構(gòu)建了一株支持HCV和HBV完整生活周期的新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01。借助于該感染體系,初步揭示了若干宿主應(yīng)答病毒感染的先天免疫反應(yīng)節(jié)點。RIG-I通路在HCV感染誘導(dǎo)I型干擾素產(chǎn)生和引發(fā)TRAIL介導(dǎo)的病毒感染細(xì)胞凋亡途徑中起關(guān)鍵作用。mi R-942通過調(diào)控ISG12a表達(dá)可介導(dǎo)Noxa依賴的HCV所致細(xì)胞凋亡。
【關(guān)鍵詞】：HCV HBV HLCZ01 先天免疫反應(yīng) 細(xì)胞凋亡 ISG12a miR-942
【學(xué)位授予單位】：湖南大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.6
【目錄】：

• 摘要5-7
• Abstract7-10
• 英文縮寫10-15
• 第1章 緒論15-36
• 1.1 肝炎病毒概述15-22
• 1.1.1 丙型肝炎病毒的基本特征15-19
• 1.1.2 乙型肝炎病毒的基本特征19-22
• 1.2 肝炎病毒感染模型簡介22-26
• 1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)模型22-24
• 1.2.2 動物模型24-26
• 1.3 模式識別受體簡介26-30
• 1.3.1 RIG-I樣受體26-28
• 1.3.2 Toll樣受體28-29
• 1.3.3 其它模式識別受體29-30
• 1.4 抗病毒天然免疫蛋白30-32
• 1.5 病毒免疫逃逸機(jī)制32-35
• 1.5.1 病毒因素32-34
• 1.5.2 宿主因素34-35
• 1.6 本論文的設(shè)計思路35-36
• 第2章 新型肝癌細(xì)胞系HLCZ01的分離與鑒定36-47
• 2.1 前言36
• 2.2 實驗材料36-37
• 2.2.1 材料與試劑36-37
• 2.2.2 儀器設(shè)備37
• 2.3 實驗方法37-43
• 2.3.1 體外分離和培養(yǎng)原代肝癌細(xì)胞37-38
• 2.3.2 小鼠成瘤實驗38
• 2.3.3 Western Blot實驗步驟38-39
• 2.3.4 Immunofluorescence實驗步驟39-40
• 2.3.5 Real-time PCR實驗步驟40-42
• 2.3.6 統(tǒng)計學(xué)分析42-43
• 2.4 結(jié)果與討論43-46
• 2.4.1 HLCZ01細(xì)胞具有肝細(xì)胞特征43-44
• 2.4.2 HLCZ01細(xì)胞表達(dá)HCV受體44-46
• 2.5 小結(jié)46-47
• 第3章 HLCZ01支持HCV和HBV感染的完整生活周期47-79
• 3.1 前言47-48
• 3.2 實驗材料48
• 3.2.1 材料與試劑48
• 3.2.2 儀器設(shè)備48
• 3.3 實驗方法48-53
• 3.3.1 HBV感染方法48-49
• 3.3.2 HCV感染方法49
• 3.3.3 HBV和HCV sera感染方法49-50
• 3.3.4 ELISA檢測HBV病毒蛋白50
• 3.3.5 Southern Blot實驗步驟50-51
• 3.3.6 Northern Blot實驗步驟51
• 3.3.7 Lamivdine動物實驗51
• 3.3.8 流式細(xì)胞儀檢測病毒感染細(xì)胞51-52
• 3.3.9 免疫電鏡52
• 3.3.10 Western Blot實驗步驟52
• 3.3.11 Immunofluorescence實驗步驟52
• 3.3.12 Real-time PCR實驗步驟52-53
• 3.3.13 統(tǒng)計學(xué)分析53
• 3.4 結(jié)果與討論53-78
• 3.4.1 HLCZ01細(xì)胞支持HCV感染53-60
• 3.4.2 HLCZ01細(xì)胞支持HBV感染60-74
• 3.4.3 HLCZ01細(xì)胞支持HCV和HBV共感染74-78
• 3.5 小結(jié)78-79
• 第4章 HCV誘導(dǎo)HLCZ01和PHH產(chǎn)生有效的先天免疫應(yīng)答79-98
• 4.1 前言79
• 4.2 實驗材料79-80
• 4.2.1 材料與試劑79-80
• 4.2.2 儀器設(shè)備80
• 4.3 實驗方法80-83
• 4.3.1 HCV感染方法80
• 4.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡80-81
• 4.3.3 Western Blot實驗步驟81
• 4.3.4 過表達(dá)和沉默載體構(gòu)建81
• 4.3.5 Immunofluorescence實驗步驟81
• 4.3.6 Real-time PCR實驗步驟81-82
• 4.3.7 統(tǒng)計學(xué)分析82-83
• 4.4 結(jié)果與討論83-96
• 4.4.1 HCV感染HLCZ01和PHH可誘導(dǎo)IFN-β和ISGs表達(dá)83-87
• 4.4.2 HCV誘導(dǎo)HLCZ01和PHH細(xì)胞凋亡87-90
• 4.4.3 TRAIL介導(dǎo)HCV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡90-92
• 4.4.4 HCV誘導(dǎo)的先天免疫應(yīng)答依賴于RIG-I通路92-96
• 4.5 小結(jié)96-98
• 第5章 MIR-942通過調(diào)控ISG12A表達(dá)以介導(dǎo)NOXA依賴的HCV所致細(xì)胞凋亡98-110
• 5.1 前言98
• 5.2 實驗材料98-99
• 5.2.1 材料與試劑98-99
• 5.2.2 儀器設(shè)備99
• 5.3 實驗方法99-101
• 5.3.1 HCV感染方法99
• 5.3.2 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡99
• 5.3.3 過表達(dá)和沉默載體構(gòu)建99-100
• 5.3.4 雙熒光素酶報告基因檢測100
• 5.3.5 Western Blot實驗步驟100
• 5.3.6 Immunofluorescence實驗步驟100
• 5.3.7 Real-time PCR實驗步驟100-101
• 5.3.8 統(tǒng)計學(xué)分析101
• 5.4 結(jié)果與討論101-108
• 5.4.1 ISG12a介導(dǎo)HCV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡101-102
• 5.4.2 MiR-942靶向于ISG12a以調(diào)控HCV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡102-105
• 5.4.3 ISG12a調(diào)控HCV誘導(dǎo)的肝細(xì)胞凋亡依賴于Noxa105-108
• 5.5 小結(jié)108-110
• 結(jié)論110-112
• 參考文獻(xiàn)112-133
• 附錄A 攻讀學(xué)位期間所發(fā)表的學(xué)術(shù)論文133-135
• 附錄B 攻讀學(xué)位期間所申請的發(fā)明專利135-136
• 致謝136-137

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本文編號：772935