本文關(guān)鍵詞：穩(wěn)定表達(dá)shRNA的間充質(zhì)干細(xì)胞治療乙型肝炎肝損傷的研究

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【摘要】：乙型肝炎病毒(Hepatitis B virus,HBV)感染使人類(lèi)患急性或慢性乙型肝炎。急性乙型肝炎一般不會(huì)造成嚴(yán)重的肝損傷,絕大多數(shù)成年患者的病毒會(huì)被自發(fā)清除。慢性乙型肝炎會(huì)導(dǎo)致肝損傷,甚至?xí)l(fā)肝硬化和肝癌�？茖W(xué)研究發(fā)現(xiàn)慢性乙型肝炎引發(fā)的肝損傷不是由HBV感染直接引發(fā)肝細(xì)胞凋亡形成的,而是機(jī)體免疫細(xì)胞清除被感染的肝細(xì)胞時(shí)造成的。治療慢性乙型肝炎的方法主要是藥物治療,目前有兩類(lèi)標(biāo)準(zhǔn)藥物。一種是核苷酸類(lèi)似物,其作用是直接抑制病毒復(fù)制,但是停藥后易發(fā)生復(fù)發(fā),長(zhǎng)期服用易導(dǎo)致病毒變異產(chǎn)生耐藥性。另一種是干擾素類(lèi)藥物,通過(guò)調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)使其清除病毒,但是其價(jià)格昂貴且副作用多。并且這兩種藥物只能抑制病毒復(fù)制,無(wú)法對(duì)已經(jīng)損傷的肝臟進(jìn)行修復(fù),并不能有效的治療慢性乙型肝炎。本文為了在抑制HBV復(fù)制的同時(shí)對(duì)肝損傷進(jìn)行修復(fù),使用穩(wěn)定表達(dá)短發(fā)夾RNA(short hairpin RNA,sh RNA)的小鼠永生型間充質(zhì)干細(xì)胞(mi MSC)對(duì)慢性乙型肝炎肝損傷進(jìn)行治療。sh RNA是一種人工的RNA分子,可通過(guò)RNA干擾(RNA interference,RNAi)通路沉默目的基因。HBV基因組是非常合適的RNAi靶點(diǎn),目前有很多研究表明sh RNA可以有效的抑制HBV復(fù)制。然而,對(duì)于中后期慢性乙型肝炎患者來(lái)說(shuō),盡管體內(nèi)HBV的復(fù)制被抑制,但肝損傷程度仍很?chē)?yán)重,并且容易引發(fā)肝硬化甚至肝癌,因此僅僅抑制HBV復(fù)制是不夠的,還需要同時(shí)治療肝損傷重建肝功能。研究表明間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymal stem cells,MSCs)移植不會(huì)引起免疫排斥反應(yīng),并且移植后MSCs能向損傷處遷移并分化成為肝細(xì)胞樣細(xì)胞重建肝功能,同時(shí)MSCs容易獲取,在體內(nèi)容易增殖。因此MSCs被認(rèn)為是干細(xì)胞移植治療肝損傷的理想細(xì)胞來(lái)源。為了評(píng)價(jià)穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC(mi MSC-sh RNA)對(duì)慢性乙型肝炎肝損傷的療效,我們需要一種合適的動(dòng)物模型,由于小鼠免疫系統(tǒng)已經(jīng)被全面的了解,可以在人工環(huán)境下飼養(yǎng)和繁育,體型較小,我們想利用小鼠作為HBV感染損傷的動(dòng)物模型。但是由于HBV有非常嚴(yán)格的宿主物種限制范圍,自然條件下HBV不能感染小鼠肝細(xì)胞。因此我們將已成型的兩種鼠模型疊加,即尾靜脈高壓注射法建立的急性乙型肝炎鼠模型和CCl4誘導(dǎo)的肝損傷鼠模型,建立模擬慢性乙型肝炎肝損傷小鼠模型,這樣其體內(nèi)既能模擬HBV的復(fù)制又有肝損傷的形成。首先,我們從文獻(xiàn)報(bào)道中選出兩個(gè)高效的RNAi靶點(diǎn),分別是S基因上的157i靶點(diǎn)和X基因上的1694i靶點(diǎn),并將這兩個(gè)靶點(diǎn)的序列構(gòu)建到sh RNA表達(dá)載體上得到Hygro-157-1694 sh RNA表達(dá)質(zhì)粒。再將Hygro-157-1694 sh RNA表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染到含有HBV基因組的Hep G2.2.15細(xì)胞中,對(duì)該質(zhì)粒的沉默效率進(jìn)行評(píng)價(jià),發(fā)現(xiàn)其可以有效抑制HBV基因組的轉(zhuǎn)錄和表達(dá)。然后,我們用Hygro-157-1694 sh RNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建了穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC細(xì)胞系,通過(guò)體外分化實(shí)驗(yàn)證明其具有多種分化潛力,在一定培養(yǎng)條件下可以分化為成骨細(xì)胞和肝細(xì)胞樣細(xì)胞,并且這些肝細(xì)胞樣細(xì)胞能表達(dá)一些肝細(xì)胞特異的蛋白,同時(shí)也具有肝細(xì)胞的新陳代謝和儲(chǔ)存糖原的功能。最后,我們將穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC細(xì)胞系移植到乙型肝炎肝損傷鼠模型體內(nèi),通過(guò)mi MSC的分化和分泌細(xì)胞因子功能對(duì)肝損傷進(jìn)行治療和肝功能進(jìn)行重建。另一方面mi MSC及其分化得到的肝細(xì)胞樣細(xì)胞仍能穩(wěn)定表達(dá)sh RNA,防止新生成的肝細(xì)胞樣細(xì)胞被HBV感染,從而提高肝損傷治療的效率。以達(dá)到一次給藥卻能同時(shí)抑制病毒復(fù)制、治療肝損傷重建肝功能的設(shè)想。我們通過(guò)ELISA法檢測(cè)模型鼠血漿內(nèi)乙型肝炎病毒表面抗原(HBs Ag),e抗原(HBe Ag)含量和q RT-PCR法檢測(cè)模型鼠肝臟HBV S基因的m RNA含量,發(fā)現(xiàn)穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC細(xì)胞系對(duì)血清內(nèi)表面抗原和e抗原的表達(dá)沒(méi)有抑制效果,但其可以降低肝臟內(nèi)S基因的m RNA含量。另外我們通過(guò)檢測(cè)模型鼠血清內(nèi)谷丙轉(zhuǎn)氨酶,谷草轉(zhuǎn)氨酶含量;模型鼠肝重體重比;天狼星紅法對(duì)治療后小鼠肝臟切片染色三種方法評(píng)價(jià)穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC細(xì)胞系對(duì)模型鼠的肝損傷治療效果,發(fā)現(xiàn)其可以有效的治療肝損傷恢復(fù)肝功能。本文通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)證明了穩(wěn)定表達(dá)sh RNA的mi MSC細(xì)胞系可以在一定程度上抑制乙型肝炎肝損傷模型鼠肝內(nèi)HBV的轉(zhuǎn)錄,同時(shí)對(duì)肝損傷的治療和肝功能的恢復(fù)都有良好的療效,本文為治療慢性乙型肝炎肝損傷提供了新的思路。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 肝損傷 短發(fā)夾RNA 間充質(zhì)干細(xì)胞
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類(lèi)號(hào)】：R512.62;R575
【目錄】：

• 摘要4-7
• Abstract7-13
• 第1章 前言13-24
• 1.1 HBV概述13-18
• 1.1.1 HBV基因組和病毒顆粒結(jié)構(gòu)13-15
• 1.1.2 HBV復(fù)制過(guò)程15-16
• 1.1.3 HBV感染動(dòng)物模型16-18
• 1.1.4 HBV感染引發(fā)的肝損傷形成機(jī)制18
• 1.1.5 慢性乙型肝炎治療進(jìn)展18
• 1.2 短發(fā)夾RNA概述18-20
• 1.2.1 shRNA用于治療乙型肝炎研究進(jìn)展18-19
• 1.2.2 shRNA作用機(jī)制19-20
• 1.3 MSCs概述20-22
• 1.3.1 肝細(xì)胞樣細(xì)胞的鑒定方法21
• 1.3.2 MSCs治療肝損傷的機(jī)制21-22
• 1.4 本文的立題依據(jù)22-24
• 第2章 實(shí)驗(yàn)材料和方法24-35
• 2.1 材料與試劑24-25
• 2.1.1 工具酶24
• 2.1.2 菌株和細(xì)胞24
• 2.1.3 試劑盒24-25
• 2.1.4 主要試劑25
• 2.1.5 試劑配制方法25
• 2.2 主要儀器25-26
• 2.3 實(shí)驗(yàn)方法26-35
• 2.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及轉(zhuǎn)染26
• 2.3.2 穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞系構(gòu)建及單克隆篩選26-28
• 2.3.3 Western blot28-29
• 2.3.4 miMSC向成骨細(xì)胞分化29
• 2.3.5 茜素紅染色29
• 2.3.6 miMSCs向肝細(xì)胞分化29-30
• 2.3.7 RT-PCR30-32
• 2.3.8 糖原染色32
• 2.3.9 尿素含量檢測(cè)32
• 2.3.10 miMSC移植治療模擬乙型肝炎肝損傷鼠模型32
• 2.3.11 小鼠脾內(nèi)移植miMSC32-33
• 2.3.12 血清處理方法33
• 2.3.13 ELISA法33
• 2.3.14 AST、ALT含量的測(cè)定33
• 2.3.15 冷凍切片33-34
• 2.3.16 天狼星紅染色34-35
• 第3章 結(jié)果與討論35-53
• 3.1 miMSC-sh RNA的構(gòu)建及鑒定35-40
• 3.1.1 慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建miMSC-shRNA35-36
• 3.1.2 Hygro1571694質(zhì)粒構(gòu)建及沉默效率檢測(cè)36-38
• 3.1.3 Hygro質(zhì)粒系統(tǒng)構(gòu)建miMSC-shRNA及沉默效率檢測(cè)38-40
• 3.2 miMSC-sh RNA的體外分化及檢測(cè)40-47
• 3.2.1 向成骨細(xì)胞分化41-42
• 3.2.2 向肝細(xì)胞分化42-46
• 3.2.3 miMSC-shRNA向肝細(xì)胞分化后抑制HBV復(fù)制檢測(cè)46-47
• 3.3 miMSC-sh RNA治療乙型肝炎肝損傷小鼠模型47-53
• 3.3.1 miMSC-shRNA2移植抑制HBsAg和HBeAg的表達(dá)48
• 3.3.2 miMSC-shRNA2移植降解小鼠肝臟內(nèi)S基因的mRNA48-49
• 3.3.3 肝重/體重49-50
• 3.3.4 ALT、AST檢測(cè)50-51
• 3.3.5 天狼星紅染色51-53
• 第4章 討論53-55
• 參考文獻(xiàn)55-61
• 致謝61-62
• 作者簡(jiǎn)介62

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1 曾樂(lè);肝損傷的保守治療[J];中國(guó)急救醫(yī)學(xué);2002年05期

2 岳蘭竹;付蓉;阮二寶;梁勇;劉鴻;瞿文;宋嘉;關(guān)晶;王曉明;王國(guó)錦;王化泉;邢莉民;吳玉紅;王s，

本文編號(hào)：772250