本文關(guān)鍵詞：清脂護(hù)肝方及Src抑制劑PP2在非酒精性脂肪性肝病中的作用機(jī)制探討

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【摘要】：背景：非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fatty liver disease, NAFLD)是一種以無過量飲酒史和其他明確肝損害因素引起的肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞的脂肪變性、壞死以及炎性細(xì)胞的浸潤和脂肪積貯等為特征的臨床病理綜合癥。非酒精性脂肪肝炎(Non-alcohlic Steatohepatitis, NASH)是指肝細(xì)胞脂肪變性、小葉和/或匯管區(qū)炎癥,有時伴有肝纖維化和Mallory小體形成的一種病理狀態(tài),在NAFLD中占30%-50%,這是造成非酒精性脂肪性肝硬化、肝癌等并發(fā)癥的重要環(huán)節(jié),阻斷這一環(huán)節(jié)就能夠改變NAFLD的預(yù)后,因此探討清脂護(hù)肝方及Src抑制劑PP2在NASH中的作用及其機(jī)制可為臨床治療NAFLD提供一定的理論依據(jù)。目的：通過觀察清脂護(hù)肝方及Src抑制劑PP2對NASH大鼠肝功能、血脂、炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)以及NASH大鼠肝組織和kupffer細(xì)胞中Src家族相關(guān)激酶(Hck、 Lyn、Fgr)和Src抑制的蛋白激酶C底物(Src-suppressed C kinase substrate, SSeCKS)表達(dá)的影響,探討清脂護(hù)肝方及Src抑制劑PP2在NASH中的作用及其機(jī)制。方法：人體水平研究：選取2012-2014年南通市第三人民醫(yī)院病理科經(jīng)診斷為NAFLD的肝組織蠟塊12例,以及正常肝組織10例,用免疫組織化學(xué)(Immunohistochemistry, IHC)方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表達(dá)水平。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：qRT-PCR:培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞,采用Trizol一步法提取RNA并反轉(zhuǎn)錄成cDNA,用q RT-PCR方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hc、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表達(dá)情況；培養(yǎng)生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞,用60%濃度CCL4損傷液刺激4h[2]后用20%清脂護(hù)肝方藥物血清(前期實(shí)驗(yàn)研究表明：清脂護(hù)肝方藥物血清添加量為20%時,增值實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)最高,效果最好)及Src抑制劑PP2(濃度為5、10、20、40ug/ml)繼續(xù)培養(yǎng)48h后提取RNA,并反轉(zhuǎn)錄成cDN A,采用q RT-PCR方法檢測藥物干預(yù)前后Src家族相關(guān)激酶(Hck、 Lyn、Fgr)和SSeCKS分子mRNA的表達(dá)情況；免疫細(xì)胞化學(xué)(Immunocytochemistry, ICC):對生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞,用60%濃度CCL4損傷液刺激4h后分別用20%清脂護(hù)肝方藥物血清繼續(xù)培養(yǎng)48h和Src抑制劑PP2刺激30min,用ICC的方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表達(dá)水平；蛋白質(zhì)免疫印跡法(Western Blot):收集生長狀態(tài)良好的kupffer細(xì)胞,提取蛋白,采用Western Blot的方法檢測Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和 SSeCKS分子 mRNA的表達(dá)情況。動物實(shí)驗(yàn)：選用2月齡雄性SD大鼠喂養(yǎng)高脂飼料制備成NASH模型,將造模成功的大鼠再隨機(jī)分為模型組、PP2組、低劑量清脂護(hù)肝方組、中劑量清脂護(hù)肝方組和高劑量清脂護(hù)肝方組,模型組予0.9%NaCl溶液灌胃；清脂護(hù)肝方組分別以2.43g/kg/d,12.15g/kg/d,24.3g/kg/d灌胃6周；PP2組于造模后第1天至第5天腹腔注射10mmol/LSrc抑制劑PP2 0.1ml,對照組注射等體積生理鹽水。觀察記錄大鼠的行為表現(xiàn)及體質(zhì)量變化。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后,處死實(shí)驗(yàn)大鼠,采用OLYMPUS全自動生化分析儀及配套試劑檢測肝功能及血脂；并對肝組織病理切片采用蘇木精-伊紅染色觀察大鼠脂肪變性及炎癥程度；IHC法檢測NASH大鼠肝組織中Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)和SSeCKS分子的表達(dá)水平；ELISA法檢測血清中NASH炎癥因子(IL-1、IL-6、TNF-α)的表達(dá)情況。結(jié)果：人體水平研究：IHC結(jié)果表明：Hck、Lyn在人體正常肝組織中低表達(dá),炎癥組織中表達(dá)增高,二者比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；而在正常肝組織或肝臟炎癥組織中Fgr、SSeCKS均未見明顯表達(dá)。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)：q RT-PCR:Hck、Lyn mRNA 在 Kuffer細(xì)胞中的表達(dá)豐度滿足敲減實(shí)驗(yàn)要求,SSeCKS mRNA 在 Kuffer細(xì)胞中表達(dá)豐度較低,不滿足敲減實(shí)驗(yàn)要求,而Fgr mRNA 在 Kuffer細(xì)胞中沒有表達(dá)；用60%CCL4損傷液刺激后Hck、Lyn mRNA表達(dá)明顯升高(P0.05), SSeCKS mRNA表達(dá)減少,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；用清脂護(hù)肝方藥物血清及Src抑制劑PP2干預(yù)后：Hck、Lyn mRNA表達(dá)降低,且呈劑量依賴性；SSeCKS mRNA表達(dá)稍有升高,而Fgr mRNA未見表達(dá)。ICC:Hck 在 kupffer細(xì)胞中有表達(dá),呈棕黃色顆粒,并與炎癥程度呈正相關(guān),藥物血清及Src抑制劑PP2培養(yǎng)后表達(dá)減少,棕黃色顆粒明顯變錢、變少,呈散在分布；而Lyn、Fgr和SSeCKS在kupffer細(xì)胞中無明顯表達(dá)；Western Blot:Hck、Lyn、SSeCKS在鼠kupffer細(xì)胞中均有表達(dá),尤以Hck、SSeCKS表達(dá)明顯,而Fgr在鼠kupffer細(xì)胞中未見明顯表達(dá)。動物實(shí)驗(yàn)：IHC結(jié)果表明：Lyn、Hck在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞低表達(dá),炎癥刺激時高表達(dá),且與炎癥反應(yīng)呈極高正相關(guān)；SSeCKS則在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞低表達(dá),炎癥刺激時表達(dá)減少,與炎癥反應(yīng)程度呈負(fù)相關(guān)；Fgr在正常肝臟組織kupffer細(xì)胞極低表達(dá),炎癥刺激后幾乎不表達(dá)；用清脂護(hù)肝方及Src抑制劑PP2對NASH大鼠進(jìn)行干預(yù)治療后,我們發(fā)現(xiàn)用藥組無論是低、中、高劑量組或是PP2組,在抑制Hck、Lyn兩種Src相關(guān)激酶成員的陽性表達(dá)時有顯著效果,特別是高劑量組,與模型組比較有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)；模型組SSeCKS蛋白的表達(dá)顯著低于正常組,在治療組中的表達(dá)介于模型組和正常組,同時伴隨Lyn、Hck表達(dá)的升高呈減少趨勢；且清脂護(hù)肝方對Fgr的表達(dá)無明顯影響,用藥前后無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05); ELISA:與正常組比較,模型組NASH炎癥因子IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),TNF-α表達(dá)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)；與模型組比較,中、高劑量組IL-1、IL-6表達(dá)有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),尤以高劑量組明顯,TNF-α表達(dá)無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論：當(dāng)炎癥刺激時,SSeCKS與Lyn、Hck的表達(dá)呈負(fù)相關(guān),Lyn與Hck的表達(dá)呈正相關(guān)；我們推斷SSeCKS與Src家族相關(guān)激酶(Lyn、Hck)存在某種上下游抑制關(guān)系；Fgr與Lyn、Hck家族成員本身可能存在某種競爭抑制作用；提示Src家族相關(guān)激酶(Lyn、Hck、Fgr)/SSeCKS分子信號通路參與了NAFLD的發(fā)生發(fā)展,可作為NAFLD炎癥反應(yīng)的一個潛在調(diào)控靶點(diǎn)。清脂護(hù)肝方能夠調(diào)控Hck、Lyn、SSeCKS的表達(dá)從而減輕肝臟的炎癥反應(yīng),是其治療NAFLD的作用機(jī)制之一。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪肝病 非酒精性脂肪性肝炎 清脂護(hù)肝方 Src抑制劑PP2Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr) SSeCKS分子
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.5
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-13
• 前言13-15
• 第一部分 理論研究15-25
• 1. 非酒精性脂肪性肝病的西醫(yī)現(xiàn)狀與進(jìn)展15-20
• 1.1 定義、分類及流行病學(xué)15
• 1.2 病因和發(fā)病機(jī)制15-16
• 1.3 臨床表現(xiàn)及診斷16-18
• 1.4 西醫(yī)對非酒精性脂肪性肝病的治療18-20
• 1.5 非酒精性脂肪性肝病的預(yù)后20
• 1.6 非酒精性脂肪性肝病的預(yù)防20
• 2. 中醫(yī)學(xué)對非酒精性脂肪性肝病的認(rèn)識20-23
• 2.1 病名及定義的探討20-21
• 2.2 病因病機(jī)的探討21
• 2.3 辨證論治及分型21-22
• 2.4 中醫(yī)藥治療非酒精性脂肪性肝病22-23
• 3. 清脂護(hù)肝方的相關(guān)研究23-24
• 4. Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)/SSeCKS分子的相關(guān)研究24-25
• 5. PP2的相關(guān)研究25
• 第二部分 實(shí)驗(yàn)研究25-52
• 1. 材料25-27
• 1.1 實(shí)驗(yàn)動物及細(xì)胞25
• 1.2 藥品及試劑25-27
• 1.3 主要儀器27
• 2. 方法27-35
• 2.1 人體水平研究27-28
• 2.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)28-33
• 2.3 動物實(shí)驗(yàn)33-34
• 2.4 統(tǒng)計(jì)方法34-35
• 3. 結(jié)果35-46
• 3.1 人體水平研究結(jié)果35-36
• 3.2 細(xì)胞實(shí)驗(yàn)36-39
• 3.3 動物實(shí)驗(yàn)39-46
• 4. 討論46-50
• 4.1 Src家族相關(guān)激酶(Hck、Lyn、Fgr)的表達(dá)46-47
• 4.2 Src抑制的蛋白激酶C底物(SSeCKS)的表達(dá)47-48
• 4.3 關(guān)于清脂護(hù)肝方的研究48-50
• 4.4 關(guān)于PP2的研究50
• 5. 結(jié)論50-52
• 參考文獻(xiàn)52-56
• 附表56-57
• 攻讀碩士學(xué)位期間取得的學(xué)術(shù)成果57-58
• 致謝58

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：766989