本文關(guān)鍵詞：NE在非酒精性脂肪性肝炎kupffer細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制以及黃連素對其影響

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【摘要】：庫普弗細(xì)胞(kupffer cell, KC)活化在非酒精性脂肪性肝炎(nonalcoholic steatohepatitis,NASH)的發(fā)生和發(fā)展中起著十分重要的作用。非酒精性脂肪性肝病(nonalcoholic fattty liver disease, NAFLD)整個疾病進(jìn)程中(NAFL-NASH-肝纖維化)均可見肝小葉內(nèi)中性粒細(xì)胞(neutroph il,也稱多形核白細(xì)胞,polymorphonuclear leukocyte,PMN)浸潤。本研究首先明確了PMNs在NASH早期炎癥啟動中的作用及其對kupffer細(xì)胞的活化作用；其次通過臨床研究發(fā)現(xiàn)PMNs通過其分泌的中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶(neutrophil elastase, NE)在NASH炎癥中的重要作用,且升高的NE及其內(nèi)源性抑制劑a1-抗胰蛋白酶(α1-antitrypsin, A1AT的降低可以作為NASH的預(yù)測因子；然后以NE抑制劑Sivelestat對NASH炎癥和kupffer細(xì)胞活化進(jìn)行了干預(yù)研究,并在體外直接證明了NE活化kupffer細(xì)胞的TLR4依賴機(jī)制；最后以黃連素(berberine, BBR)在NASH小鼠模型進(jìn)行干預(yù),發(fā)現(xiàn)通過降低NE活性并減少kupffer細(xì)胞活化可能是BBR治療NASH的重要機(jī)制。第一部分NE在NASH kupffer細(xì)胞活化中的作用和機(jī)制研究實(shí)驗(yàn)一PMNs介導(dǎo)早期kupffer細(xì)胞活化的研究目的明確中性粒細(xì)胞在NASH早期炎癥啟動中的作用及其在kupffer細(xì)胞活化中的作用。方法C57BL/6J小鼠分別以正常飲食(standard chow,SC)和蛋氨酸膽堿缺乏(methionine/choline-defecient, MCD)飲食喂養(yǎng)1,2,4,8周。中性粒細(xì)胞特異性抗體(Anti-Ly6G)用來耗竭小鼠外周血中性粒細(xì)胞。CD68, F4/80免疫組化染色以及熒光定量RT-PCR用來檢測kupffer細(xì)胞活化。結(jié)果在炎癥早期(1-2周),注射Ab-Ly6G小鼠血清ALT水平顯著低于注射IgG的對照組,肝臟脂肪變與炎癥也明顯減輕,但在炎癥后期(第4、8周)耗竭外周血中性粒細(xì)胞不能明顯減輕NASH小鼠的炎癥。CD68, F4/80免疫組化染色以及熒光定量RT-PCR提示注射Ab-Ly6G能夠延緩kupffer細(xì)胞的活化。結(jié)論中性粒細(xì)胞在NASH早期炎癥啟動和kupffer細(xì)胞活化中具有重要作用。實(shí)驗(yàn)二NE在NASH發(fā)生和發(fā)展中的作用(臨床研究)目的觀察NE及其內(nèi)源性抑制劑AIAT在NASH組織學(xué)炎癥進(jìn)展中作用以及NE,A1AT對NASH的預(yù)測作用。方法共納入研究對象252例(NALFD組,n=202；健康對照組,n=50)。所有研究對象均進(jìn)行了臨床生化指標(biāo),NE和A1AT的濃度檢測。NAFLD組中有86例患者進(jìn)行了肝穿,并進(jìn)行了組織學(xué)炎癥評分和纖維化程度分級。ROC曲線下面積用于評價(jià)NE-A1AT對NASH的預(yù)測作用。結(jié)果NAFLD患者血清NE濃度升高,A1AT濃度降低,導(dǎo)致NE/A1AT比值失調(diào)。NE濃度升高在單純性脂肪肝階段即開始出現(xiàn),A1AT降低則從可疑NASH階段開始,NASH患者則N E/AiAT比值升高。當(dāng)NAFLD進(jìn)展到進(jìn)展期纖維化階段,升高的NE/A1AT比值開始回復(fù)正常。A1AT預(yù)測N ASH的敏感性為83.8%,特異性為83.3%,cut-off值為-1459.43；NE/A1AT預(yù)測NASH的敏感性為88.8%,特異性為83.3%,cut-off值為0.363。結(jié)論血清NE/A1AT比值升高與NASH炎癥程度密切相關(guān),并能作為預(yù)測NASH的重要血清學(xué)標(biāo)志。實(shí)驗(yàn)三NE抑制劑Sivelestat對NASH的防治作用和kupffer細(xì)胞活化的干預(yù)作用目的明確NE抑制劑Sivelestat對NASH的防治作用及可能機(jī)制。方法4周齡C57BL/6J ApoE-/雄性小鼠40只分為：(1)正常飲食SC+生理鹽水組,(2)SC+Sivelestat組,(3)高脂高膽固醇飲食(High-fat high-cholesterol, HFHC)+生理鹽水組,(4)HFHC+ Sivelestat組。連續(xù)喂養(yǎng)12周后取血和肝臟檢測血清生化指標(biāo),肝組織油紅0染色評價(jià)脂肪變程度,HE染色進(jìn)行NAFLD活動度評分(NAFLD activity score, NAS)評價(jià)炎癥反應(yīng)。熒定量RT-PCR以及免疫組化檢測肝臟炎癥因子以及CD68水平。結(jié)果HFHC飲食12周能誘導(dǎo)ApoE-/-小鼠出現(xiàn)典型NASH表現(xiàn)。Sivelestat干預(yù)組空腹血糖(FPG)、血膽固醇(TC)和肝功能較模型組明顯降低,胰島素敏感性增加,NAS積分降低(5.71±1.11 vs3.16±1.16,P0.05),腫瘤壞死因子(TNF-a)和單核細(xì)胞趨化蛋白-1(MCP-1)也降低。Sivelestat干預(yù)后CD68和F4/80的mRNA水平明顯降低,免疫組化顯示CD68在肝臟內(nèi)表達(dá)減少。結(jié)論NE抑制劑Sivelestat對NASH的防治作用明確,減少kupffer細(xì)胞活化可能是其防治NASH的重要機(jī)制。實(shí)驗(yàn)四重組NE (recombinant NE, rNE)活化kupffer細(xì)胞的體外研究目的體外進(jìn)一步明確NE對kupffer細(xì)胞的活化作用及其TLR4依賴機(jī)制方法分離TLR4野生型(TLR4 wild-type, TLR4-WT)和TLR4突變(TLR4-mutant, TLR4mut)小鼠kupffer細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)3天。收細(xì)胞前6小時予100nM rNE蛋白進(jìn)行刺激,以加熱失活的NE作為對照。提取RNA后,熒光定量RT-PC R測定炎癥細(xì)胞因子MCP-1,TNF-α, IL-1β等。結(jié)果TLR4-WT的kupffer以rNE刺激后炎癥因子MCP-1, TNF-α以及IL-1β的mRNA水平明顯升高。TLR4mut小鼠的kupffer細(xì)胞經(jīng)同樣劑量的rNE刺激后則沒有出現(xiàn)相應(yīng)炎癥因子的變化。結(jié)論rNE依賴于TLR4體外活化kupffer細(xì)胞。第二部分黃連素對N ASH小鼠模型NE介導(dǎo)Kupffer活化的影響研究目的明確BBR對NASH的干預(yù)作用及其對NE介導(dǎo)kupffer細(xì)胞活化機(jī)制的調(diào)控。方法8周齡C57BL/6J ApoE-/-雄性小鼠分為SC組、HFHC組以及BBR干預(yù)組。干預(yù)組6周起予以200mg/kg的BBR灌胃,12周處死所有小鼠。稱體重、肝濕重、檢測血糖、血脂、肝功能。油紅O染色評價(jià)脂肪變,HE染色進(jìn)行炎癥評分。酶聯(lián)免疫反應(yīng)(ELISA)檢測肝組織中NE濃度、蛋白免疫印跡(Western Blot, WB)方法檢測NE水平,熒光發(fā)光法檢測肝組織中NE活性。熒定量RT-PCR以及免疫組化檢測肝臟炎癥因子以及CD68和F4/80的水平。結(jié)果與SC組相比,模型組小鼠ALT、AST均明顯升高(P0.05),TG明顯高于對照組(P0.01)。小鼠體重、肝濕重增加,油紅O染色面積、密度增加,HE染色可見明顯脂肪變及炎癥灶,伴明顯氣球樣變,NAS積分達(dá)到NASH診斷標(biāo)準(zhǔn)(NAS5)。BBR干預(yù)組較HFHC組血清ALT、AST、TC水平較模型組明顯降低(P0.05),且油紅O染色面積、密度較模型組減少,炎癥氣球樣變較模型組減少,炎癥因子的表達(dá)也減少。BBR干預(yù)組小鼠肝臟內(nèi)NE活性,蛋白水平以及濃度均較模型組降低,kupffer活化程度也明顯減輕。結(jié)論BBR有效將低NASH小鼠的體重、血糖、血脂以及肝功能,改善肝臟組織學(xué)炎癥。降低肝臟內(nèi)NE水平后減少kupffer細(xì)胞活化可能是其干預(yù)NASH的作用機(jī)制。
【關(guān)鍵詞】：非酒精性脂肪性肝炎 庫普弗細(xì)胞 中性粒細(xì)胞 中性粒細(xì)胞彈性蛋白酶 Toll樣受體4 黃連素
【學(xué)位授予單位】：浙江中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.1
【目錄】：

• 中文摘要7-11
• ABSTRACT11-15
• 前言15-18
• 第一部分 NE在NASH kupffer細(xì)胞活化的作用和機(jī)制研究18-47
• 一、實(shí)驗(yàn)一 中性粒細(xì)胞介導(dǎo)NASH早期kupffer細(xì)胞活化的研究(動物實(shí)驗(yàn)）18-26
• (一) 實(shí)驗(yàn)材料與方法18-22
• 1. 實(shí)驗(yàn)動物18
• 2. 實(shí)驗(yàn)藥物18-19
• 3. 實(shí)驗(yàn)議器19
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法19-22
• (二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果22-23
• (三) 分析與討論23-25
• (四) 小結(jié)25-26
• 二、實(shí)驗(yàn)二 NE在NASH發(fā)生發(fā)展中的作用（臨床研究）26-37
• (一) 實(shí)驗(yàn)材料與方法26-27
• 1. 研究對象26
• 2. 研究方法26-27
• (二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果27-34
• (三) 分析與討論34-36
• (四) 小結(jié)36-37
• 三、實(shí)驗(yàn)三 NE抑制劑Sivelestat防治NASH及抑制kupfeer細(xì)胞活化37-43
• (一) 實(shí)驗(yàn)材料與方法37-39
• 1. 實(shí)驗(yàn)動物37
• 2. 實(shí)驗(yàn)藥物和試劑37
• 3. 實(shí)驗(yàn)議器37
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法37-39
• (二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果39-40
• (三) 分析與討論40-42
• (四) 小結(jié)42-43
• 四、實(shí)驗(yàn)四 rNE通過TLR4介導(dǎo)loipffer細(xì)胞活化的研究(體外研究，，此部分實(shí)驗(yàn)在香港大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物醫(yī)藥技術(shù)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室完成)43-47
• (一) 實(shí)驗(yàn)材料與方法43-45
• 1. 實(shí)驗(yàn)動物43
• 2. 實(shí)驗(yàn)試劑及其配方43
• 3. 實(shí)驗(yàn)議器43-44
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法44-45
• (二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果45-46
• (三) 分析與討論46
• (四) 小結(jié)46-47
• 第二部分 BBR對非酒精性脂化性肝炎NE介導(dǎo)Kuffer活化的影響研究47-54
• (一) 實(shí)驗(yàn)材料與方法47-50
• 1. 實(shí)驗(yàn)動物47
• 2. 實(shí)驗(yàn)藥物及試劑47
• 3. 實(shí)驗(yàn)議器47-48
• 4. 實(shí)驗(yàn)方法48-50
• (二) 實(shí)驗(yàn)結(jié)果50-52
• (三) 分析與討論52-53
• (四) 小結(jié)53-54
• 結(jié)論54-55
• 參考文獻(xiàn)55-60
• 附圖60-76
• 致謝76-77
• 文獻(xiàn)綜述77-85
• 參考文獻(xiàn)82-85

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本文編號：712846