發(fā)布時(shí)間：2017-08-14 00:32

  本文關(guān)鍵詞：失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用

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【摘要】：第一部分:失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究目的:建立失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)體外培養(yǎng)體系,并探討其生物學(xué)特性。方法:采用密度梯度離心和貼壁培養(yǎng)法相結(jié)合,培養(yǎng)基為含自體血清間充質(zhì)干細(xì)胞培養(yǎng)基,從失代償性肝硬化患者骨髓中分離培養(yǎng)間充質(zhì)干細(xì)胞(mesenchymal stem cells,MSCs),觀察骨髓MSCs的培養(yǎng)成功率、原代培養(yǎng)時(shí)間,測(cè)定生長(zhǎng)曲線,流式細(xì)胞儀分析鑒定MSCs的純度。結(jié)果:失代償性肝硬化患者BMSCs的體外分離培養(yǎng)成功率100%(9/9);BMSCs的原代培養(yǎng)時(shí)間為(13.0±2.3)天,傳代培養(yǎng)時(shí)間(8.4±1.7)天;BMSCs具有相似的形態(tài),均呈梭形,成纖維細(xì)胞樣細(xì)胞,P3代骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的純度可達(dá)95%,其高表達(dá)CD44(95.01%)、CD29(92.79%),低表達(dá)CD34(1.31%)、CD45(1.08%),符合MSCs的免疫學(xué)特征。結(jié)論:肝硬化患者來(lái)源的MSCs具有MSCs的共同生物學(xué)特性,使用自體血清培養(yǎng)基體外培養(yǎng)的肝硬化患者BMSCs生長(zhǎng)穩(wěn)定,增殖旺盛,能連續(xù)傳代,可能是替代原位肝移植(orthotopic liver transplantation,OLT)的理想的“種子細(xì)胞”。第二部分:失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用目的:探討失代償期乙型肝炎肝硬化患者骨髓MSCs對(duì)自體外周血T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用。方法:分離失代償性肝硬化患者外周血淋巴細(xì)胞行羧基熒光素乙酰乙酸琥珀酰亞胺酯(carboxy-fluorescein diacetate succinimidyl ester,CFDA SE)熒光染色,在植物血凝素(phytohemagglutinin,PHA)刺激下,培養(yǎng)基為自體血清,自體外周血淋巴細(xì)胞與P3代BMSCs共培養(yǎng),實(shí)驗(yàn)分四組:①BMSCs+淋巴細(xì)胞+PHA接觸培養(yǎng)組;②BMSCs+淋巴細(xì)胞+PHA非接觸培養(yǎng)組;③淋巴細(xì)胞+PHA陽(yáng)性對(duì)照組;④單獨(dú)淋巴細(xì)胞陰性對(duì)照組。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)各組淋巴細(xì)胞增殖情況和CD4+CD25+CD127-調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells,Tregs)及CD4+CD8-IL-17+輔助性T細(xì)胞17(T helper 17 cell,Th17)細(xì)胞頻數(shù),逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-PCR)檢測(cè)BMSCs的白細(xì)胞介素-10(interleukin-10,IL-10)及轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1(transforming growth factor-β1,TGF-β1)m RNA表達(dá)水平。結(jié)果:流式細(xì)胞術(shù)顯示:1.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組的細(xì)胞增殖較陽(yáng)性對(duì)照組明顯減低(P0.01),但亦顯著高于陰性對(duì)照組(P0.01),其組間比較,淋巴細(xì)胞增殖無(wú)顯著差異(P0.05);2.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Tregs細(xì)胞頻率顯著高于陽(yáng)性及陰性對(duì)照組(P0.01),但其組間比較Tregs頻數(shù)無(wú)顯著差異(P0.05);3.接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組的Th17細(xì)胞頻率顯著高于陰性對(duì)照組(P0.01),但低于陽(yáng)性對(duì)照組(P0.01),其組間比較亦無(wú)顯著差異(P0.05);4.培養(yǎng)前后組內(nèi)比較:接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Treg/Th17比率均明顯上調(diào)(P均0.01),而陽(yáng)性及陰性對(duì)照組變化不明顯(P均0.05)。培養(yǎng)后組間比較,接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組Treg/Th17比率顯著高于陽(yáng)性及陰性對(duì)照組(P均0.01),其組間比較亦無(wú)顯著差異(P0.05)。RT-PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示:培養(yǎng)前后組內(nèi)比較,培養(yǎng)后接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相對(duì)水平均顯著高于培養(yǎng)前(P均0.01);培養(yǎng)后組間比較,接觸培養(yǎng)組及非接觸培養(yǎng)組TGF-β1 m RNA和IL-10m RNA相對(duì)水平均無(wú)顯著差異(P0.05)。結(jié)論:失代償期乙型肝炎肝硬化患者的骨髓MSCs可抑制自體淋巴細(xì)胞增殖,顯著上調(diào)Tregs表達(dá),并改善Treg/Th17失衡,其免疫調(diào)節(jié)機(jī)制可能與分泌抑制性細(xì)胞因子IL-10、TGF-β1有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：肝硬化 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 培養(yǎng) 生物學(xué)特性 肝硬化 骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞 Treg Th17 Treg/Th17 IL-10 TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：蘇州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類(lèi)號(hào)】：R575.2
【目錄】：

• 中文摘要4-6
• Abstract6-10
• 前言10-12
• 第一部分 失代償性肝硬化患者骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的研究12-20
• 一、材料12-13
• 二、方法13-15
• 三、結(jié)果15-17
• 四、討論17-20
• 第二部分 失代償性肝硬化患者的骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)T淋巴細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)作用20-38
• 一、材料20-21
• 二、方法21-26
• 三、結(jié)果26-33
• 四、討論33-38
• 參考文獻(xiàn)38-44
• 全文總結(jié)44-45
• 綜述45-56
• 參考文獻(xiàn)51-56
• 英文縮略詞表56-57
• 攻讀學(xué)位期間公開(kāi)發(fā)表的論文57-58
• 致謝58-59

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：669878