本文關(guān)鍵詞：人膽囊炎致病菌對豚鼠腸道屏障及其結(jié)構(gòu)蛋白的影響

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【摘要】：現(xiàn)代生活中,隨著人類飲食結(jié)構(gòu)和生活方式的改變,近年來膽囊炎的發(fā)病率有增高的趨勢。對于膽囊炎的發(fā)病機制有多種假說,細菌感染為其假說之一。本課題組前期工作中,通過檢測臨床樣本,發(fā)現(xiàn)膽囊炎患者的膽汁中有細菌存在,并分離鑒定出一株感染性大腸桿菌Enteroinvasive Escherichia Coli(EIEC)。動物實驗證實,口服該菌能夠使豚鼠產(chǎn)生膽囊炎。這些證據(jù)提示該菌為人類膽囊炎的致病菌。本課題旨在揭示該致病菌如何穿透腸道屏障入血的機制,為最終闡明細菌性膽囊炎發(fā)病的分子機制提供理論依據(jù)。本課題模擬抗生素導(dǎo)致腸道屏障受損狀態(tài),并通過PCR-變性梯度凝膠電泳(PCR-DGGE)技術(shù)來鑒定該狀態(tài)的存在,然后分組處理模式動物,一組用鼠李糖乳酸桿菌灌胃,作為陽性對照;另一組用本實驗室特有菌種E.coli O124 K72灌胃。最后通過PCR-DGGE電泳結(jié)果來觀察腸道菌群變化,并通過HE染色切片來觀察腸道形態(tài)學(xué)改變。研究表明,腸道病原菌可以通過改變腸道緊密連接蛋白的屏障結(jié)構(gòu)與功能,使其有利于細菌的入侵和感染,從而具有操縱宿主的功能。本課題通過免疫組化來分析腸道緊密連接蛋白的表達情況,并檢測肝中,血中是否含有該致病菌,探究該致病菌是否通過消耗腸道粘液為碳源,從而突破腸道屏障入血?還是該致病菌將腸道屏障破壞,從而引起其他細菌大量入血入肝,最后入膽引起膽囊炎?目的本課題旨在揭示該致病菌如何穿透腸道屏障入血的機制,為最終闡明細菌性膽囊炎發(fā)病的分子機制提供理論依據(jù)。通過模擬抗生素導(dǎo)致腸道屏障受損狀態(tài),并由PCR-DGGE技術(shù)來鑒定該狀態(tài)的存在,然后分組處理模式動物,一組用鼠李糖乳酸桿菌灌胃,另一組用本實驗室特有菌種E.coli O124 K72灌胃。最后通過PCR-DGGE電泳結(jié)果來觀察腸道菌群變化,并通過HE染色切片來觀察腸道的形態(tài)學(xué)改變。通過免疫組化來分析腸道緊密連接蛋白的表達情況,并檢測肝中,血中是否含有該致病菌,探究該致病菌是否通過消耗腸道粘液為碳源,從而突破腸道屏障入血?還是該致病菌將腸道屏障破壞,從而引起其他細菌大量入血入肝,最后入膽引起膽囊炎?方法1、采用抗生素給動物灌胃,以提高感染性大腸桿菌的感染效果�？股刈笱醴承前凑找�(guī)定計量給兩組豚鼠灌胃10天,分別在不同天數(shù)收集豚鼠糞便。并用試劑盒對糞便總DNA進行提取。然后利用PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,變性梯度凝膠電泳)對上述糞便DNA進行分離分析,觀察其多樣性的變化,以及整體趨勢,確定腸道菌群失衡。并選擇感興趣的條帶進行切膠回收,構(gòu)建克隆載體,鑒定菌種等。2、通過灌胃方式將從急性膽囊炎患者膽汁中分離獲得的致病菌接種到豚鼠體內(nèi),并通過特異性引物檢測豚鼠血清中是否含有該致病菌,肝臟組織研磨液中是否含有該致病菌。3、通過病理切片觀察其對豚鼠腸道形態(tài)結(jié)構(gòu)的影響,以確定損傷。利用IHC技術(shù)來檢測腸道上皮細胞封閉蛋白Occludin和緊密連接蛋白Claudin 2的表達情況,對比各組之間的變化,來研究豚鼠的腸屏障功能是否遭到破壞。探索該致病菌是通過哪些途徑對膽道系統(tǒng)造成影響的。4、利用real-time PCR在m RNA水平檢測不同處理組間,腸道粘液分泌相關(guān)蛋白的基因表達情況,探討腸道屏蔽損傷機制。結(jié)果1.PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,變性梯度凝膠電泳),結(jié)果顯示,抗生素處理不同天數(shù)腸道菌群多樣性呈遞減趨勢。2.測序結(jié)果顯示抗生素處理過后,益生菌種類減少,致病菌種類增加,其中Bifidobacterium magnum(雙歧桿菌)在抗生素處理三天后顯著減少;Desulfotomaculum thermocisternum(脫硫腸狀菌屬)的菌量隨著抗生素處理天數(shù)的增加呈現(xiàn)遞減趨勢;Streptococcus constellatus(星座鏈球菌)在正常組沒有,隨著抗生素給藥天數(shù)增加,該菌逐漸出現(xiàn)。此外還檢測出Desul Fovibrio(脫硫弧菌),Hyphomonas neptunium(生絲單胞菌屬),Tetragenococcus halophilus subsp.Halophilus(嗜鹽四聯(lián)球菌)等。3.Real-time PCR結(jié)果顯示.Anti+E.coli組,粘液分泌相關(guān)蛋白Muc13,Muc15,Muc1,基因表達水平較正常組和益生菌組顯著增加。4.E.coli O124 K72侵染豚鼠實驗的結(jié)果顯示,大腸桿菌灌胃組(Anti+E.coli),其病理切片顯示結(jié)腸壁內(nèi)大量空泡組織,顯示高腳杯細胞增生,并伴有輕度炎癥。5.免疫組化顯示益生菌組(Anti+LGG)Claudin-2含量較正常對照組(CG.)有所增加,但無統(tǒng)計學(xué)意義;而Anti+E.coli組Claudin-2含量較正常組顯著增加(P0.05)。Occludin表達量與上一組結(jié)果正好相反。6.將各組肝臟組織研磨液進行培養(yǎng),并設(shè)計E.coli O124 K72的特意性引物,對菌液進行特異性擴增,但并未檢測出肝臟中有該致病菌存在,同理血清中也沒有該致病菌,但是益生菌組的肝臟研磨液中發(fā)現(xiàn)一種益生菌存在,Bacillus toyonensis。結(jié)論:1、本課題采用PCR-DGGE(Denaturing Gradient Gel Electrophoresis,變性梯度凝膠電泳)對抗生素處理過的模式動物糞便細菌總DNA進行定性、半定量分析,觀察腸道菌群整體變化趨勢。比較抗生素處理過和正常組腸道菌群組成的差異,系統(tǒng)全面的揭示抗生素對腸道菌群的破壞,確定造模成功。2、Real-time PCR結(jié)果顯示.Anti+E.coli組,粘液分泌相關(guān)蛋白Muc13,Muc15,Muc1基因表達水平較正常組和益生菌組顯著增加。說明腸道長期遭受致病菌侵襲,不但其結(jié)構(gòu)會發(fā)生改變,基因水平上也會有變化,而且這幾種粘液分泌蛋白表達增高,也說明腸道的一種炎癥癥狀,大量分泌粘液,是腸道對抗外界刺激的一種自我保護。3、免疫組化的結(jié)果顯示,E.coli(O124 K72)接種到豚鼠體內(nèi),腸粘膜結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,并上調(diào)Claudin 2的表達,下調(diào)Occludin的表達使腸道屏障功能和遭到破壞有關(guān)。
【關(guān)鍵詞】：抗生素 腸道菌群 PCR-DGGE 致病性大腸桿菌 益生菌 Claudin 2 Occludin
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R575.61
【目錄】：

• 摘要7-10
• Abstract10-14
• 前言14-15
• 材料和方法15-39
• 1. 材料15-16
• 1.1 動物與菌種15
• 1.2 要主儀器15
• 1.3 主要試劑15
• 1.4 主要試劑的配置15-16
• 2. 實驗方法16-28
• 2.1 動物模型的制備16
• 2.2 糞便樣品DNA提取16-22
• 2.3 石蠟切片及HE染色22-24
• 2.4 免疫組化檢測腸道緊密連接蛋白（Claudin 2 和Occludin）表達的變化24-25
• 2.5 結(jié)腸組織RNA的提取(Trizol研磨法)25-26
• 2.6 實時定量PCR（Real-time PCR）檢測結(jié)腸分泌蛋白MUC家族基因的表達26-27
• 2.7 肝臟組織和血清細菌培養(yǎng)27-28
• 結(jié)果28-37
• 討論37-38
• 參考文獻38-39
• 綜述 腸道菌群紊亂與腸道屏障功能的關(guān)系39-50
• 1. 結(jié)腸黏膜屏障之粘蛋白40-43
• 1.1 粘蛋白MUC140-41
• 1.2 粘蛋白MUC1341-42
• 1.3 粘蛋白MUC1542-43
• 2. 結(jié)腸屏障之緊密連接蛋白43-45
• 2.1 緊密連接蛋白CLDN243-44
• 2.2 跨膜蛋白Occludin44-45
• 參考文獻45-50
• 致謝50-51

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本文編號：665869