本文關(guān)鍵詞：缺血再灌注條件下IEC來源的BMP4和IL-7相互作用調(diào)節(jié)IEL凋亡研究

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【摘要】：研究背景:腸缺血再灌注損傷(ischemic/reperfusion,I/R)是在嚴(yán)重感染、創(chuàng)傷、心肺功能不全、器官移植等的過程中常見組織器官損傷之一。腸粘膜屏障是一個復(fù)雜的屏障結(jié)構(gòu),主要由機械屏障、免疫屏障、生物屏障、化學(xué)屏障等不同組分組成。其中由腸上皮細(xì)胞(intestinal epithelial cell,IEC)和腸上皮間淋巴細(xì)胞(intestianl intr aepithelial lymphocytes,IEL)為主組成的機械屏障和免疫屏障是決定腸屏障功能的核心因素。IEL作為一群主要由T淋巴細(xì)胞組成的特殊細(xì)胞群構(gòu)建的腸免疫屏障,IEC與IEL相互緊密,IEC可通過分泌的蛋白因子直接接觸作用于IELs,調(diào)控IEL的增殖、分化、凋亡等。因此深入研究探討IEC對IEL的調(diào)控機制,將有助于闡明應(yīng)激條件下腸粘膜屏障功能障礙的發(fā)病機制。在腸道遭受到I/R損傷后,腸粘膜屏障在維持腸道內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定、阻礙內(nèi)毒素轉(zhuǎn)移等功能受到限制,其中最主要的原因是腸上皮細(xì)胞和腸上皮間淋巴細(xì)胞組成的機械屏障、免疫屏障受到極大破壞。前期研究發(fā)現(xiàn)小腸在胃腸外營養(yǎng)、缺氧、缺血再灌注刺激下腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4蛋白分泌表達(dá)增加,BMP4通過傳導(dǎo)下游信號可促進(jìn)促炎因子的釋放,進(jìn)一步加重腸黏膜屏障功能損傷。已有研究發(fā)現(xiàn)胸腺上皮細(xì)胞來源的BMP4可通過Smad信號影響前體細(xì)胞CD34+的成熟,進(jìn)而抑制胸腺內(nèi)T淋巴細(xì)胞的分化,使機體的免疫功能下降,而IL-7可以抵消BMP4對CD34+的影響。IELs作為腸道特殊免疫淋巴細(xì)胞,在維持腸黏膜免疫屏障功能穩(wěn)定起重要作用。在TPN和I/R刺激下,IEL的功能降低、數(shù)量減少、凋亡增加使腸黏膜屏障功能障礙加重。為了進(jìn)一步研究在缺血再灌注下腸上皮細(xì)胞對腸上皮間淋巴細(xì)胞的調(diào)控機制。因此,本文擬通過體外實驗檢測在缺血再灌注刺激下腸上皮細(xì)胞來源的BMP4和IL-7相互作用調(diào)節(jié)腸上皮間淋巴細(xì)胞凋亡的研究而展開的,為在缺血再灌注下IEC-IEL的對話機制研究提供一定的實驗基礎(chǔ)。方法:1.制作小鼠腸I/R損傷模型,6小時后頸椎脫臼處死小鼠,取出小腸上段空腸組織制作石蠟切片和冰凍切片,HE染色觀察腸黏膜絨毛形態(tài)學(xué)變化,免疫熒光技術(shù)檢測腸上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4、IL-7蛋白表達(dá)變化。2.將小鼠頸椎脫臼處死,取全程小腸,提取小鼠腸IEL細(xì)胞,采用RT-PCR、流式細(xì)胞術(shù)驗證IEL中存在BMP信號通路蛋白表達(dá)。3.將小鼠缺血再灌注處理6小時后,提取腸上皮間淋巴細(xì)胞,用Sham作為對照組,用流式細(xì)胞術(shù)檢測在IEL中BMP和IL-7信號通路蛋白表達(dá)變化。4.將提取的IEL單獨培養(yǎng),加入外源性BMP4、IL-7蛋白,采用流式細(xì)胞術(shù)檢測IEL的凋亡率表達(dá)變化。5.給予外源性IL-7蛋白刺激IEC-6、IEL后,Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)BMP4、p-NF-k B蛋白表達(dá)變化。6.在IEC-6、IEL中給予外源性BMP4蛋白刺激后,Western-blot、流式技術(shù)檢測胞內(nèi)IL-7、IL-7R/CD127蛋白表達(dá)變化。結(jié)果:1.腸缺血再灌注處理6小時后,光鏡下發(fā)現(xiàn)腸黏膜部分絨毛斷裂、細(xì)胞脫落、部分結(jié)構(gòu)消失。同時,免疫熒光技術(shù)觀察到腸IEC內(nèi)BMP4蛋白表達(dá)明顯增強,絨毛內(nèi)的IL-7蛋白表達(dá)明顯減少。2.在IEL中通過RT-PCR瓊脂糖凝膠電泳發(fā)現(xiàn)存在BMP經(jīng)典信號通路關(guān)鍵分子BMPRIA、BMPRIB、Smad1、Smad5、Smad8、p-NF-k B的表達(dá),同時用流式技術(shù)驗證IEL中存在BMPRIA、BMPRIB、p-NF-k B的表達(dá)。3.小鼠小腸在缺血再灌注條件下,IEL中BMPRIA、BMPRIB、P-Smad1/5、p-NF-k B表達(dá)量較Sham組明顯增高,同時IL-7R/CD127、P-STAT5表達(dá)明顯減少。4.給予外源性BMP4刺激后,可誘導(dǎo)IEL的凋亡率增加。給予NOGGIN、PDTC、IL-7聯(lián)合刺激后,IEL中的IEL凋亡率與Control組無明顯差異。5.在IL-7刺激下,IEC中BMP4表達(dá)下調(diào),IEL中BMP信號下調(diào)。6.給予外源性BMP4刺激下,IEC-6中IL-7蛋白表達(dá)下調(diào),在IEL中的IL-7R/CD127及P-STAT5蛋白表達(dá)減少.結(jié)論:1.在I/R損傷刺激下,腸黏膜部分絨毛斷裂、細(xì)胞脫落、結(jié)構(gòu)消失,腸屏障功能遭到極大破壞;腸黏膜上皮細(xì)胞內(nèi)BMP4蛋白表達(dá)增加、IL-7表達(dá)減弱。2.IEL中存在BMP信號通路表達(dá),且在腸I/R損傷刺激下IEL內(nèi)BMP信號通路的激活。3.BMP4通過與IEL內(nèi)BMP受體結(jié)合,激活Smad、NF-k B信號通路,進(jìn)一步誘導(dǎo)IEL的凋亡率增加。4.在外源性IL-7刺激下,BMP信號通路在腸IEC與IEL中傳遞受到抑制,阻礙BMP4對IEL的凋亡促進(jìn)作用。5.在I/R下,腸黏膜細(xì)胞中IL-7/CD127信號通路蛋白表達(dá)減少,給予外源性BMP4刺激后,IL-7/CD127信號通路傳遞抑制,進(jìn)一步加重腸粘膜屏障功能受損。
【關(guān)鍵詞】：缺血再灌注損傷 腸黏膜上皮間淋巴細(xì)胞 腸黏膜上皮細(xì)胞 BMP4 IL-7
【學(xué)位授予單位】：第三軍醫(yī)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號】：R574
【目錄】：

• 縮略語表4-5
• 英文摘要5-8
• 中文摘要8-11
• 第一章 前言11-13
• 第二章 在缺血再灌注條件下BMP信號在腸上皮細(xì)胞和腸上皮間淋巴細(xì)胞中表達(dá)變化的研究13-34
• 2.1 材料與方法13-24
• 2.2 實驗結(jié)果24-31
• 2.3 討論31-34
• 第三章 在缺血再灌注下IL-7 與BMP4相互作用調(diào)控腸上皮間淋巴細(xì)胞凋亡的研究34-48
• 3.1 材料和方法34-40
• 3.2 實驗結(jié)果40-45
• 3.3 討論45-48
• 全文總結(jié)48-49
• 參考文獻(xiàn)49-51
• 文獻(xiàn)綜述 BMP信號通路在腸道缺血再灌注損傷中的作用51-59
• 參考文獻(xiàn)55-59
• 學(xué)位期間發(fā)表的論文59-60
• 致謝60

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