本文關(guān)鍵詞：ERK-MLCK通路介導(dǎo)褪黑素對(duì)食管上皮緊密連接作用的機(jī)制研究

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【摘要】：胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)是指胃內(nèi)容物反流入食管,引起不適癥狀和(或)并發(fā)癥的一種疾病。胃酸被認(rèn)為是GERD的重要致病因子。食管粘膜防御功能下降對(duì)于GERD的發(fā)生具有重要意義。食管粘膜防御屏障:由上皮屏障完成,包括上皮細(xì)胞膜和細(xì)胞間緊密連接(tight junction,TJ)。研究發(fā)現(xiàn),GERD患者食管上皮存在細(xì)胞間隙增寬(dilated intercellular spaces,DIS),這是食管上皮連接屏障受損的標(biāo)志�？缒さ鞍護(hù)ccludin、claudin通過支架蛋白ZO-1固定于細(xì)胞骨架、使相鄰細(xì)胞間形成“拉鏈”式連接、共同構(gòu)成TJ的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ),維持上皮連接屏障的完整性。大量實(shí)驗(yàn)室及臨床研究提示,TJ蛋白表達(dá)或分布異常,可作為GERD食管上皮連接屏障受損的客觀指標(biāo)。然而,目前其分子機(jī)制尚不清楚。促分裂素原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信號(hào)通路是真核細(xì)胞中介導(dǎo)細(xì)胞反應(yīng)的重要信號(hào)系統(tǒng)。MAPK信號(hào)系統(tǒng)包括細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERK)、c-Jun氨基末端激酶(JNK)和p38 MAPK。不同組織及細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn),ERK、JNK和p38 MAPK均可參與細(xì)胞連接屏障的調(diào)節(jié)過程;其中,關(guān)于ERK調(diào)節(jié)細(xì)胞連接屏障的報(bào)道最多。在未受刺激的細(xì)胞中,MAPK信號(hào)分子主要分布于細(xì)胞質(zhì)中;在適宜刺激下,多個(gè)MAPK家族成員被激活,迅速且顯著的移入細(xì)胞核中、活化轉(zhuǎn)錄因子、調(diào)節(jié)參與細(xì)胞反應(yīng)的基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)。MAPK信號(hào)通路通過影響肌球蛋白輕鏈激酶(myosin light chain kinase,MLCK)的表達(dá)及活性,實(shí)現(xiàn)對(duì)細(xì)胞連接屏障的調(diào)節(jié)。MLCK是一種鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)依賴性激酶,廣泛存在于上皮細(xì)胞中。MLCK通過磷酸化肌球蛋白輕鏈(myosin light chain,MLC),使三磷酸腺苷(Adenosine Triphosphate,ATP)依賴的肌動(dòng)球蛋白收縮,由此引起的細(xì)胞骨架收縮、胞膜回縮、DIS形成、TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1分布變化,這是細(xì)胞連接屏障損傷的經(jīng)典機(jī)制。MLCK還可改變胞內(nèi)Ca2+濃度、調(diào)節(jié)TJ蛋白的表達(dá)、影響細(xì)胞連接屏障。研究發(fā)現(xiàn),在腸上皮細(xì)胞中,ERK活化促使下游轉(zhuǎn)錄因子Elk-1活化并入核,觸發(fā)MLCK基因活化、m RNA轉(zhuǎn)錄、蛋白合成、上皮連接屏障開放、粘膜通透性增加。但迄今為止,尚未見食管上皮連接屏障調(diào)控機(jī)制的相關(guān)研究報(bào)道。當(dāng)前,質(zhì)子泵抑制劑(proton pump inhibitors,PPIs)因其強(qiáng)大的抑制胃酸作用,被作為GERD的一線治療藥物。由于GERD慢性過程、易復(fù)發(fā)的特點(diǎn),患者需要長期使用PPI,且久用PPI有許多副作用。2006年一項(xiàng)研究顯示,口服褪黑素(melatonin,MLT)可以顯著緩解GERD患者的癥狀而未見副作用;大量實(shí)驗(yàn)證實(shí),MLT對(duì)GERD/RE食管粘膜具有保護(hù)作用。MLT是一種吲哚胺神經(jīng)激素,具有復(fù)雜的生物學(xué)效應(yīng),包括調(diào)節(jié)睡眠周期、晝夜節(jié)律、生殖節(jié)律、血壓波動(dòng),調(diào)節(jié)免疫功能,清除氧自由基,抑制腫瘤生長等等;給予外源性MLT,通過多種途徑可以保護(hù)消化道粘膜。在視網(wǎng)膜屏障、腎小管上皮細(xì)胞、腸上皮細(xì)胞、人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞等多項(xiàng)研究中發(fā)現(xiàn):(1)MLT通過調(diào)節(jié)細(xì)胞骨架來影響TJ,發(fā)揮對(duì)細(xì)胞連接屏障的保護(hù)作用。(2)MLT還通過抑制MAPK信號(hào)途徑、調(diào)控MLCK表達(dá)以及活性,保護(hù)人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞連接屏障。(3)MLT可特異性的與鈣調(diào)蛋白(calmodulin,Ca M)及PKC相互作用,抑制MLCK活性。文獻(xiàn)報(bào)道關(guān)注了MLT在抗炎、抗氧化機(jī)制上、對(duì)GERD的治療作用。本研究以食管上皮連接屏障(即TJ屏障)為靶點(diǎn),探討MLT對(duì)TJ的保護(hù)作用(及其機(jī)制),為GERD治療提供了新的思路。第一部分胃食管反流病食管上皮細(xì)胞間隙及緊密連接蛋白變化目的:探討胃食管反流病(GERD)患者食管上皮細(xì)胞間隙增寬(DIS)及緊密連接(TJ)蛋白變化的可能機(jī)制。方法:根據(jù)“納排標(biāo)準(zhǔn)”將胃鏡檢查的患者分為對(duì)照組、NERD組和RE組。用一次性活檢鉗夾取食管下段(齒狀線上3-5CM)光滑無破損的粘膜組織分別保存于液氮、4%多聚甲醛、3%戊二醛備用。用透射電鏡觀察患者食管上皮細(xì)胞間隙,免疫組化檢測TJ蛋白的分布、real-time PCR檢測TJ基因m RNA表達(dá),western blot檢測TJ蛋白、MAPK和MLCK的表達(dá)。結(jié)果:(1)NERD和RE患者的食管上皮細(xì)胞間隙均較對(duì)照組顯著增寬,且主要見于棘細(xì)胞層。(2)與對(duì)照組相比,NERD和RE患者TJ m RNA和蛋白表達(dá)均顯著降低;免疫組化顯示,NERD和RE患者的TJ蛋白在胞膜附近的連續(xù)性被破壞,部分食管上皮細(xì)胞中TJ蛋白出現(xiàn)了表達(dá)缺失。(3)NERD和RE患者的食管上皮細(xì)胞MLCK表達(dá)水平和活性均顯著上調(diào);MAPK信號(hào)分子中,ERK1/2磷酸化水平顯著上調(diào),JNK和p38MAPK無明顯變化。(4)對(duì)DIS和TJ蛋白、MLCK表達(dá)/活性進(jìn)行相關(guān)性分析,結(jié)果顯示:DIS與TJ蛋白水平呈負(fù)相關(guān),與MLCK表達(dá)/活性呈正相關(guān)。結(jié)論:GERD患者食管上皮出現(xiàn)明顯DIS;食管上皮TJ蛋白表達(dá)減少、且表達(dá)的連續(xù)性破壞;MLCK和ERK1/2可能參與以上病變過程。第二部分ERK-MLCK通路介導(dǎo)酸損傷食管上皮緊密連接目的:探討酸對(duì)食管上皮細(xì)胞緊密連接的作用及機(jī)制。方法:培養(yǎng)正常人食管上皮細(xì)胞(Het-1A)。(1)用臺(tái)盼藍(lán)細(xì)胞計(jì)數(shù)法檢測不同酸性條件下、不同培養(yǎng)時(shí)間,Het-1A細(xì)胞的活力,用上皮電阻儀和熒光分光光度計(jì)分別檢測Het-1A細(xì)胞單層的跨上皮電阻(TER)和FITC-dextran通透性。(2)用western blot、real-time PCR和激光共聚焦免疫熒光方法,分別檢測酸(p H4.0)作用1h、6h后,TJ蛋白表達(dá)及分布變化。(3)分別用特異性ERK抑制劑(PD98059)和MLCK抑制劑(ML-7)預(yù)處理Het-1A細(xì)胞,再給予酸(p H4.0)作用1h,western blot檢測ERK1/2磷酸化以及western blot、real-time PCR檢測MLCK表達(dá)/活性。(4)用si ERK1/2使ERK1/2基因表達(dá)沉默,通過western blot、real-time PCR檢測ERK1/2表達(dá)沉默對(duì)MLCK的影響;用si MLCK使MLCK基因表達(dá)沉默,通過western blot、real-time PCR、激光共聚焦免疫熒光、跨上皮電阻(TER)和FITC-dextran通透性實(shí)驗(yàn),分別檢測MLCK表達(dá)沉默對(duì)TJ表達(dá)/分布以及Het-1A細(xì)胞單層連接屏障的影響。(5)提取細(xì)胞核蛋白,通過western blot檢測酸對(duì)相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子活化的情況。(6)用小干擾RNA沉默被酸活化的轉(zhuǎn)錄因子基因,檢測轉(zhuǎn)錄因子沉默對(duì)MLCK表達(dá)的影響。(7)用ERK抑制劑(PD98059)預(yù)處理Het-1A細(xì)胞,再給予酸(p H4.0),檢測酸對(duì)轉(zhuǎn)錄因子的活化是否受到抑制。結(jié)果:(1)酸(p H4.0)作用1h時(shí),Het-1A細(xì)胞單層的TER顯著降低、FITC-dextran通透性顯著增高。(2)酸顯著下調(diào)TJ蛋白表達(dá)水平、改變其分布,使TJ蛋白從致密、均勻、連續(xù)的胞膜表達(dá)變成了以胞漿表達(dá)為主伴隨少量、不連續(xù)的胞膜表達(dá)。(3)PD98059能夠顯著抑制酸對(duì)ERK1/2的激活作用;ML-7顯著抑制由酸上調(diào)的MLCK活性,但不影響MLCK表達(dá);PD98059既可以抑制酸上調(diào)的MLCK表達(dá),又可以抑制酸上調(diào)的MLCK活性。(4)ERK1/2表達(dá)沉默可以明顯抑制酸對(duì)MLCK表達(dá)的上調(diào)作用;MLCK表達(dá)沉默可以改善由酸破壞的Het-1A連接完整性、通透性增高,以及TJ蛋白表達(dá)和分布變化。(5)酸可以活化Het-1A細(xì)胞中的轉(zhuǎn)錄因子Elk-1與NF-κB。(6)Elk-1表達(dá)沉默可以顯著抑制由酸上調(diào)的MLCK表達(dá),NF-κB表達(dá)沉默則未見明顯影響。(7)ERK活性受到抑制后,由酸激活的Elk-1的磷酸化水平也隨之下調(diào)。結(jié)論:(1)酸通過下調(diào)TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表達(dá)水平、改變TJ蛋白分布,從而損傷食管上皮細(xì)胞連接屏障。(2)ERK1/2-Elk-1-MLCK信號(hào)途徑介導(dǎo)了酸對(duì)食管上皮細(xì)胞TJ蛋白的調(diào)節(jié),這可能是酸損傷食管上皮細(xì)胞連接屏障的機(jī)制。第三部分褪黑素通過ERK-MLCK通路保護(hù)食管上皮緊密連接目的:探討褪黑素(MLT)對(duì)酸作用下食管上皮細(xì)胞緊密連接的作用及機(jī)制。方法:(1)用不同濃度(0.1μM、1μM、10μM和20μM)和不同時(shí)間(2h、4h、6h、8h、12h)的MLT預(yù)處理Het-1A細(xì)胞、再給予酸作用,檢測Het-1A細(xì)胞單層的TER和FITC-dextran通透性。(2)將Het-1A細(xì)胞分成4組:對(duì)照組、MLT組、酸處理組、MLT+酸處理組。分別用real-time PCR和western blot方法檢測ZO-1、occludin和claudin-1的m RNA和蛋白表達(dá)水平,激光共聚焦免疫熒光檢測其表達(dá)和分布情況。(3)將Het-1A細(xì)胞分為5組:對(duì)照組、酸處理組、PD+酸處理組、MLT+酸處理組、MLT+PD+酸處理組。分別檢測ERK1/2磷酸化水平、MLCK表達(dá)水平和活性,以及轉(zhuǎn)錄因子Elk-1表達(dá)情況。結(jié)果:(1)MLT可以改善酸導(dǎo)致的Het-1A細(xì)胞單層TER降低、FITC-dextran通透性增高。(2)MLT顯著改善由酸導(dǎo)致的ZO-1、occludin和claudin-1的m RNA和蛋白表達(dá)下調(diào)、分布改變。(3)PD+酸處理組、MLT+酸處理組和MLT+PD+酸處理組中,酸導(dǎo)致的ERK1/2磷酸化、MLCK表達(dá)和活性上調(diào)均被明顯抑制,酸對(duì)轉(zhuǎn)錄因子Elk-1的活化也顯著受抑;三組之間無顯著差異。結(jié)論:MLT通過ERK1/2-Elk-1-MLCK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)節(jié)TJ蛋白ZO-1、occludin和claudin-1表達(dá)及分布,從而改善了酸對(duì)食管上皮細(xì)胞連接屏障的破壞作用。
【關(guān)鍵詞】：胃食管反流病 DIS 緊密連接 MLCK ERK1/2 酸 食管上皮連接屏障 緊密連接 ERK1/2 MLCK 轉(zhuǎn)錄因子 褪黑素 酸 食管上皮 緊密連接 ERK1/2 MLCK Elk-1
【學(xué)位授予單位】：南京醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R571
【目錄】：

• 中文摘要5-10
• Abstract10-17
• 第一部分 胃食管反流病食管上皮細(xì)胞間隙及緊密連接蛋白變化17-46
• 1. 前言17-19
• 2. 材料和方法19-29
• 3. 結(jié)果29-37
• 4. 討論37-40
• 5. 結(jié)論40-41
• 6. 參考文獻(xiàn)41-46
• 第二部分 ERK-MLCK通路介導(dǎo)酸損傷食管上皮緊密連接46-81
• 1. 前言46-48
• 2. 材料和方法48-55
• 3. 結(jié)果55-71
• 4. 討論71-74
• 5. 結(jié)論74-75
• 6. 參考文獻(xiàn)75-81
• 第三部分 ERK-MLCK通路介導(dǎo)褪黑素保護(hù)食管上皮緊密連接81-102
• 1. 前言81-83
• 2. 材料和方法83-85
• 3. 結(jié)果85-91
• 4. 討論91-94
• 5. 結(jié)論94-95
• 6. 參考文獻(xiàn)95-102
• 全文小結(jié)102-105
• 綜述105-123
• 參考文獻(xiàn)112-123
• 附錄一 中英文對(duì)照及縮略表123-125
• 附錄二 攻讀學(xué)位期間科研工作小結(jié)125-128
• 致謝128

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