本文關(guān)鍵詞：黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究

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【摘要】：目的:通過體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)研究黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染的作用和機(jī)理。方法:1.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染雛鴨體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。篩選感染鴨乙型肝炎病毒的一日齡,重約50克/只的雄性龍巖麻鴨48只,隨機(jī)分為病毒對照組,恩替卡韋治療組(0.1mg/kg),黃芪注射液高、中、低劑量(20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg)聯(lián)合恩替卡韋治療組及單用黃芪注射液高劑量治療組(20ml/kg)6個實(shí)驗(yàn)組,每組8只動物。于治療前(T0),治療7天(T7),治療14天(T14),治療21天(T21),停藥5天(P5),停藥10天(P10),停藥20天(P20)測定病毒含量并進(jìn)行比較。2.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)Hep G2.2.15細(xì)胞,將細(xì)胞分為病毒對照組,恩替卡韋治療組(30nmol/L),黃芪注射液高、中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋治療組和黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml)共8個實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)9個復(fù)孔,用CCK8比色法檢測用藥組細(xì)胞的增殖情況。分別于用藥第3天(T3),停藥第3天(P3),用PCR熒光探針方法檢測各組細(xì)胞上清和細(xì)胞內(nèi)HBVDNA。3.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究之Hep G2和Hep G2.2.15細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究。培養(yǎng)Hep G2細(xì)胞和Hep G2.2.15細(xì)胞。將未轉(zhuǎn)染乙肝病毒的Hep G2細(xì)胞作為空白對照組細(xì)胞,轉(zhuǎn)染了乙肝病毒的Hep G2.2.15細(xì)胞作為用藥組和病毒對照組細(xì)胞,將細(xì)胞分為空白組,恩替卡韋治療組(30nmol/L),黃芪注射液高、中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋治療組和黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml),病毒對照組共9個實(shí)驗(yàn)組,每組設(shè)6個復(fù)孔。用藥培養(yǎng)3天,將其中每組3個復(fù)孔細(xì)胞消化、裂解等處理后,應(yīng)用熒光定量PCR方法檢測藥物對Hep G2.2.15細(xì)胞JAK-STAT通路信號m RNA的影響,另3個復(fù)孔細(xì)胞消化、裂解等處理后,用蛋白免疫印跡(Western Blotting)方法檢測藥物對細(xì)胞內(nèi)NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的影響。4.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對刀豆蛋白ConA造成的NIH小鼠免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)研究。購買72只雄性NIH小鼠,隨機(jī)分為正常對照組,恩替卡韋治療組(45μg/kg),黃芪注射液高、中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋治療組,黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1.5、1、0.5ml/10g),模型對照組,9個實(shí)驗(yàn)組,每組8只動物。除正常對照組外,其余小鼠尾靜脈注射Con A20mg/kg后,分別于首日上、下午和次日下午各灌胃給藥一次,末次給藥后4h,模型組和各給藥組小鼠一次性靜脈注射Con A20mg/kg,禁食、不禁水,8h后摘小鼠眼球取血,離心分離血漿。測血漿中ALT、IFN-γ、TNF-α、SOD、MDA、NO,統(tǒng)計(jì)給藥前和給藥之后的變化。測各組小鼠的肝臟、脾臟、胸腺系數(shù)均值并進(jìn)行對比,取肝左葉組織,10%甲醛溶液固定,電鏡下觀察病理切片組織結(jié)構(gòu)的改變。隨機(jī)取每組3只小鼠除肝左葉以外的剩余肝臟100mg,研磨、裂解等處理后應(yīng)用蛋白免疫印跡(Western Blotting)方法觀察各組肝細(xì)胞內(nèi)NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的變化。結(jié)果:1.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染雛鴨體內(nèi)實(shí)驗(yàn)研究。本次實(shí)驗(yàn)病毒對照組動物血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定;黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋三個劑量組及恩替卡韋組在治療7天后鴨血清DHBV-DNA均出現(xiàn)明顯下降趨勢,與相同時間的病毒對照組相比較具有顯著性差異(P0.01);黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋組三個劑量組病毒載量的回升出現(xiàn)在停藥20天以后,在停藥5天、10天后并沒有出現(xiàn)病毒的明顯反跳,與相同時間的病毒對照組和給藥前相比較具有顯著性差異(P0.01),說明黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋組三個劑量組都可以延緩DHBV-DNA反彈,其中黃芪注射液中劑量聯(lián)合恩替卡韋組最為明顯;而恩替卡韋組則在停藥5天后病毒就出現(xiàn)明顯的反彈;單獨(dú)用黃芪注射液高劑量組在治療21天后鴨血清DHBV-DNA均未出現(xiàn)明顯下降趨勢,與相同時間的病毒對照組相比較沒有顯著性差異(P0.05),這說明黃芪注射液本身抗病毒作用微弱。2.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究。根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果,確定恩替卡韋作用濃度為30nmol/L,黃芪注射液作用高、中、低三個濃度為1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml。用藥3天,恩替卡韋可以抑制細(xì)胞內(nèi)、外HBVDNA分泌,與病毒對照組比較有差別(細(xì)胞內(nèi)P0.01、細(xì)胞外P0.05)。停藥3天,細(xì)胞內(nèi)、外HBVDNA定量反彈,和病毒對照組比較無差別(P0.05)。用藥3天,黃芪注射液各劑量組對細(xì)胞內(nèi)、外HBVDNA無抑制作用,與病毒對照組比較無差別(P0.05)。用藥3天,高、中劑量的黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋可以抑制細(xì)胞內(nèi)、外的HBVDNA的分泌,與病毒對照組比較有差別(細(xì)胞內(nèi)P0.01、細(xì)胞外P0.05)。停藥3天,HBVDNA的反彈明顯(P0.05),除高劑量黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋細(xì)胞外HBVDNA定量小于病毒對照組(P0.05)。余用藥組細(xì)胞內(nèi)、外HBVDNA與病毒對照組無顯著差別(P0.05)。這說明高劑量的黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋有停藥后延緩細(xì)胞外HBVDNA反彈的效果。3.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究之HepG2和Hep G2.2.15細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)研究。較之空白組細(xì)胞,病毒對照組JAK-STAT通路的ISGF3m RNA的表達(dá)下降(P0.05),余m RNA變化不明顯(P0.05)。較之病毒對照組,恩替卡韋組可使STAT2 m RNA表達(dá)增強(qiáng)(P0.05),余用藥組無影響(P0.05);恩替卡韋組和黃芪注射液中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋組可使ISGF3m RNA表達(dá)增強(qiáng)(P0.05);各組用藥對STAT1、OAS、PKR三個m RNA均沒有影響(P0.05)。病毒的感染使得細(xì)胞JAK-STAT通路的m RNA表達(dá)受到了影響,主要表現(xiàn)在ISGF3基因表達(dá)的減弱,而黃芪注射液中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋組可以使其表達(dá)恢復(fù)正常(較之空白對照組P0.05),恩替卡韋雖然也可以增強(qiáng)其表達(dá),但是效果弱于聯(lián)合用藥組(較之空白對照組P0.05)。黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對HepG2.2.15細(xì)胞炎性反應(yīng)蛋白的影響。較之空白對照組,病毒對照組各蛋白表達(dá)除Caspase3差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),其余蛋白的表達(dá)均上升明顯(P0.01)。較之病毒對照組,黃芪注射液低劑量聯(lián)合恩替卡韋組NF-κB下降(P0.05);恩替卡韋組、黃芪注射液中劑量聯(lián)合恩替卡韋組、黃芪注射液中、低劑量組OAS均下降(P0.05或P0.01);黃芪注射液低劑量聯(lián)合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組PKR下降(P0.05);余用藥組對NF-кB、OAS、PKR無影響(P0.05),各用藥組對Caspase3無影響(P0.05)。4.黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋治療刀豆蛋白(Con A)造成的NIH小鼠免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)研究。較之正常對照組,模型組ALT升高了。較之模型組,黃芪注射液小劑量組以外各用藥組均能明顯降低小鼠ALT(P0.05)。較之恩替卡韋組,黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組和恩替卡韋對ALT的降低作用相當(dāng)(P0.05),余有效用藥組效果更差(P0.01)。較之正常對照組,模型組SOD、MDA、NO均上升(P0.01)。較之模型組,各組均能降SOD(P0.01);除黃芪注射液小劑量組以外,各組均能降MDA(P0.01);各組均能降NO(P0.05或P0.01)。較之恩替卡韋組,各組降SOD作用小于恩替卡韋(P0.05或P0.01);各組降MDA作用黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組作用和恩替卡韋組相當(dāng)(P0.05),余用藥組效果小于恩替卡韋(P0.01);各組降NO作用黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組和恩替卡韋組效果相當(dāng)(P0.05),余用藥組效果小于恩替卡韋組(P0.05或P0.01)。較之正常對照組,模型組TNF-α和INF-γ均明顯升高(P0.01),較之模型組,恩替卡韋組(P0.01),及高、中劑量黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋組肝組織中的TNF-α顯著降低了(P0.05或P0.01),其余各組對TNF-α沒有顯著影響(P0.05)。較之恩替卡韋組,黃芪注射液高、中劑量聯(lián)合恩替卡韋組降TNF-α效果與恩替卡韋組相當(dāng)(P0.05);各治療組均對INF-γ有顯著降低作用(P0.01),黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組效果和恩替卡韋組相當(dāng)(P0.05),余用藥組效果比恩替卡韋組更差(P0.05或P0.01)。較之正常對照組,模型對照組NF-кB、OAS、PKR、Caspase3均升高(P0.01);較之模型對照組,恩替卡韋組NF-кB升高(P0.05),余用藥組無作用(P0.05);除黃芪注射液低劑量組和黃芪注射液中劑量聯(lián)合恩替卡韋組對OAS無影響(P0.05),余用藥組均降低了OAS(P0.05或P0.01);黃芪注射液中、低劑量聯(lián)合恩替卡韋組PKR升高(P0.05或P0.01),黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組PKR降低(P0.05),余用藥組PKR無變化(P0.05);各用藥組均對Caspase3無影響(P0.05)。肝臟系數(shù),較之正常組,模型組肝臟系數(shù)明顯增高(P0.01);較之模型組,恩替卡韋組和黃芪注射液低劑量組較之模型組有明顯的增高(P0.01),黃芪注射液中劑量組和黃芪注射液低劑量聯(lián)合恩替卡韋組沒有變化(P0.05),黃芪注射液高、中劑量聯(lián)合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組有顯著的降低作用(P0.01);較之正常組,經(jīng)黃芪注射液高劑量聯(lián)合恩替卡韋組治療后肝臟系數(shù)幾乎沒有變化(P0.05)。脾臟系數(shù),較之正常組,模型組脾臟系數(shù)明顯增高(P0.01);較之模型組,恩替卡韋和黃芪注射液低劑量組有明顯的增高(P0.01),黃芪注射液中劑量組和黃芪注射液低劑量聯(lián)合恩替卡韋組沒有變化(P0.05),黃芪注射液高、中劑量聯(lián)合恩替卡韋組和黃芪注射液高劑量組有顯著的降低作用(P0.01或P0.05)。胸腺系數(shù),較之正常組,模型組胸腺系數(shù)明顯降低(P0.01);較之模型組,恩替卡韋和黃芪注射液低劑量組有明顯的降低(P0.01),黃芪注射液中劑量組沒有變化(P0.05),聯(lián)合用藥組和黃芪注射液高劑量組可以明顯升高胸腺系(P0.01)。肝臟病理切片,各用藥組和正常組相比較,存在著組織的病理損傷(P0.01),各用藥組和模型組相比,病理損傷減輕(P0.01)。結(jié)論:黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋具有很好的抗乙型肝炎病毒感染的作用,其療效優(yōu)勢在于不僅可以很好的抑制乙型肝炎病毒的復(fù)制,而且可以在停藥后延緩乙型肝炎病毒的反彈。有關(guān)的作用機(jī)理包括調(diào)節(jié)JAK-STAT通路m RNA表達(dá)和免疫應(yīng)答所產(chǎn)生的抗病毒細(xì)胞因子和蛋白。黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對免疫性肝損傷有較好的降谷丙轉(zhuǎn)氨酶、炎性反因子、炎性反應(yīng)蛋白及保護(hù)肝細(xì)胞作用,總體來說,其抗病毒、護(hù)肝、調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)的綜合療效較之單獨(dú)使用這兩種藥物要好。黃芪注射液聯(lián)合使用或單獨(dú)使用,抗病毒和免疫調(diào)節(jié)的療效均呈劑量依賴性,實(shí)驗(yàn)證實(shí),高、中劑量的黃芪注射液使用抗病毒總體效果較好,低劑量的黃芪注射液免疫激發(fā)作用更加突出。本實(shí)驗(yàn)提示臨床使用黃芪注射液根據(jù)慢性乙型肝炎患者的病情需要靈活掌握使用濃度可控制藥效不同的發(fā)揮方向。兩藥物聯(lián)合使用可能比單獨(dú)使用恩替卡韋或黃芪注射液更加安全有效,其作用還有待臨床試驗(yàn)的驗(yàn)證。
【關(guān)鍵詞】：黃芪注射液 恩替卡韋 慢性乙型肝炎 乙型肝炎病毒 中醫(yī)中藥
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-16
• 引言16-22
• 第一章 文獻(xiàn)研究22-35
• 第一節(jié) 乙型肝炎病毒及其感染22-25
• 一、乙型肝炎病毒分類22
• 二、乙型肝炎病毒形態(tài)結(jié)構(gòu)與理化特征22-23
• 三、乙肝病毒血癥的自然史23-24
• 四、慢性乙型肝炎患者的機(jī)體免疫功能缺陷和免疫病理過程24-25
• 第二節(jié) 慢性乙型肝炎的治療25-32
• 一、慢性乙型肝炎的護(hù)肝治療25-26
• 二、慢性乙型肝炎的抗病毒治療26-29
• 三、慢性乙型肝炎的免疫調(diào)節(jié)治療29-30
• 四、慢性乙型肝炎的中醫(yī)藥治療30-32
• 第三節(jié) 慢性乙型肝炎體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ?/span>32-35
• 一、鴨乙型肝炎動物模型32-33
• 二、免疫性肝損傷動物模型33-34
• 三、乙肝病毒感染細(xì)胞模型34-35
• 第二章 實(shí)驗(yàn)技術(shù)路線圖35-39
• 第一節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究總路線圖35-36
• 第二節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染鴨動物模型體內(nèi)實(shí)驗(yàn)路線圖36-37
• 第三節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙肝病毒感染HepG2.2.15細(xì)胞體外實(shí)驗(yàn)路線圖37-38
• 第四節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋治療NIH小鼠ConA免疫性肝損傷實(shí)驗(yàn)路線圖38-39
• 第三章 實(shí)驗(yàn)研究39-78
• 第一節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗鴨乙型肝炎病毒作用的實(shí)驗(yàn)研究39-47
• 一、實(shí)驗(yàn)材料39
• 二、實(shí)驗(yàn)方法39-43
• 三、結(jié)果43-46
• 四、討論46-47
• 第二節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋對HepG2.2.15細(xì)胞HBVDNA的抑制作用47-53
• 一、實(shí)驗(yàn)材料47-48
• 二、實(shí)驗(yàn)方法48-51
• 三、結(jié)果51-52
• 四、討論52-53
• 第三節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究之一藥物對HepG2和HepG2.2.15細(xì)胞JAK-STAT通路mRNA的影響53-60
• 一、實(shí)驗(yàn)材料53-55
• 二、實(shí)驗(yàn)方法55-57
• 三、結(jié)果57-58
• 四、討論58-60
• 第四節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機(jī)理研究之二藥物對HepG2.2.15細(xì)胞NF-ΚB、OAS、PKR、Caspase3四個蛋白表達(dá)的影響60-69
• 一、實(shí)驗(yàn)材料60-61
• 二、實(shí)驗(yàn)方法61-64
• 三、結(jié)果64-66
• 四、討論66-69
• 第五節(jié) 黃芪注射液聯(lián)合恩替卡韋治療ConA致NIH小鼠免疫性肝損傷的實(shí)驗(yàn)研究69-78
• 一、實(shí)驗(yàn)材料69
• 二、實(shí)驗(yàn)方法69-70
• 三、結(jié)果70-75
• 四、討論75-78
• 結(jié)語78-79
• 參考文獻(xiàn)79-84
• 附錄84-94
• 在校期間論文發(fā)表情況94-95
• 致謝95

【參考文獻(xiàn)】

中國期刊全文數(shù)據(jù)庫 前7條

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本文編號：643135