本文關鍵詞：黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究

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【摘要】：目的:通過體內外實驗研究黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染的作用和機理。方法:1.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染雛鴨體內實驗研究。篩選感染鴨乙型肝炎病毒的一日齡,重約50克/只的雄性龍巖麻鴨48只,隨機分為病毒對照組,恩替卡韋治療組(0.1mg/kg),黃芪注射液高、中、低劑量(20ml/kg、10ml/kg、5ml/kg)聯合恩替卡韋治療組及單用黃芪注射液高劑量治療組(20ml/kg)6個實驗組,每組8只動物。于治療前(T0),治療7天(T7),治療14天(T14),治療21天(T21),停藥5天(P5),停藥10天(P10),停藥20天(P20)測定病毒含量并進行比較。2.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15細胞體外實驗研究。培養(yǎng)Hep G2.2.15細胞,將細胞分為病毒對照組,恩替卡韋治療組(30nmol/L),黃芪注射液高、中、低劑量聯合恩替卡韋治療組和黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml)共8個實驗組,每組設9個復孔,用CCK8比色法檢測用藥組細胞的增殖情況。分別于用藥第3天(T3),停藥第3天(P3),用PCR熒光探針方法檢測各組細胞上清和細胞內HBVDNA。3.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究之Hep G2和Hep G2.2.15細胞體外實驗研究。培養(yǎng)Hep G2細胞和Hep G2.2.15細胞。將未轉染乙肝病毒的Hep G2細胞作為空白對照組細胞,轉染了乙肝病毒的Hep G2.2.15細胞作為用藥組和病毒對照組細胞,將細胞分為空白組,恩替卡韋治療組(30nmol/L),黃芪注射液高、中、低劑量聯合恩替卡韋治療組和黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1000ng/ml、500ng/ml和250ng/ml),病毒對照組共9個實驗組,每組設6個復孔。用藥培養(yǎng)3天,將其中每組3個復孔細胞消化、裂解等處理后,應用熒光定量PCR方法檢測藥物對Hep G2.2.15細胞JAK-STAT通路信號m RNA的影響,另3個復孔細胞消化、裂解等處理后,用蛋白免疫印跡(Western Blotting)方法檢測藥物對細胞內NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的影響。4.黃芪注射液聯合恩替卡韋對刀豆蛋白ConA造成的NIH小鼠免疫性肝損傷實驗研究。購買72只雄性NIH小鼠,隨機分為正常對照組,恩替卡韋治療組(45μg/kg),黃芪注射液高、中、低劑量聯合恩替卡韋治療組,黃芪注射液高、中、低劑量治療組(1.5、1、0.5ml/10g),模型對照組,9個實驗組,每組8只動物。除正常對照組外,其余小鼠尾靜脈注射Con A20mg/kg后,分別于首日上、下午和次日下午各灌胃給藥一次,末次給藥后4h,模型組和各給藥組小鼠一次性靜脈注射Con A20mg/kg,禁食、不禁水,8h后摘小鼠眼球取血,離心分離血漿。測血漿中ALT、IFN-γ、TNF-α、SOD、MDA、NO,統(tǒng)計給藥前和給藥之后的變化。測各組小鼠的肝臟、脾臟、胸腺系數均值并進行對比,取肝左葉組織,10%甲醛溶液固定,電鏡下觀察病理切片組織結構的改變。隨機取每組3只小鼠除肝左葉以外的剩余肝臟100mg,研磨、裂解等處理后應用蛋白免疫印跡(Western Blotting)方法觀察各組肝細胞內NF-κB、OAS、PKR、Caspase3蛋白的變化。結果:1.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染雛鴨體內實驗研究。本次實驗病毒對照組動物血清DHBV-DNA水平穩(wěn)定;黃芪注射液聯合恩替卡韋三個劑量組及恩替卡韋組在治療7天后鴨血清DHBV-DNA均出現明顯下降趨勢,與相同時間的病毒對照組相比較具有顯著性差異(P0.01);黃芪注射液聯合恩替卡韋組三個劑量組病毒載量的回升出現在停藥20天以后,在停藥5天、10天后并沒有出現病毒的明顯反跳,與相同時間的病毒對照組和給藥前相比較具有顯著性差異(P0.01),說明黃芪注射液聯合恩替卡韋組三個劑量組都可以延緩DHBV-DNA反彈,其中黃芪注射液中劑量聯合恩替卡韋組最為明顯;而恩替卡韋組則在停藥5天后病毒就出現明顯的反彈;單獨用黃芪注射液高劑量組在治療21天后鴨血清DHBV-DNA均未出現明顯下降趨勢,與相同時間的病毒對照組相比較沒有顯著性差異(P0.05),這說明黃芪注射液本身抗病毒作用微弱。2.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染Hep G2.2.15細胞體外實驗研究。根據預實驗結果,確定恩替卡韋作用濃度為30nmol/L,黃芪注射液作用高、中、低三個濃度為1000ng/ml、500ng/ml、250ng/ml。用藥3天,恩替卡韋可以抑制細胞內、外HBVDNA分泌,與病毒對照組比較有差別(細胞內P0.01、細胞外P0.05)。停藥3天,細胞內、外HBVDNA定量反彈,和病毒對照組比較無差別(P0.05)。用藥3天,黃芪注射液各劑量組對細胞內、外HBVDNA無抑制作用,與病毒對照組比較無差別(P0.05)。用藥3天,高、中劑量的黃芪注射液聯合恩替卡韋可以抑制細胞內、外的HBVDNA的分泌,與病毒對照組比較有差別(細胞內P0.01、細胞外P0.05)。停藥3天,HBVDNA的反彈明顯(P0.05),除高劑量黃芪注射液聯合恩替卡韋細胞外HBVDNA定量小于病毒對照組(P0.05)。余用藥組細胞內、外HBVDNA與病毒對照組無顯著差別(P0.05)。這說明高劑量的黃芪注射液聯合恩替卡韋有停藥后延緩細胞外HBVDNA反彈的效果。3.黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究之HepG2和Hep G2.2.15細胞體外實驗研究。較之空白組細胞,病毒對照組JAK-STAT通路的ISGF3m RNA的表達下降(P0.05),余m RNA變化不明顯(P0.05)。較之病毒對照組,恩替卡韋組可使STAT2 m RNA表達增強(P0.05),余用藥組無影響(P0.05);恩替卡韋組和黃芪注射液中、低劑量聯合恩替卡韋組可使ISGF3m RNA表達增強(P0.05);各組用藥對STAT1、OAS、PKR三個m RNA均沒有影響(P0.05)。病毒的感染使得細胞JAK-STAT通路的m RNA表達受到了影響,主要表現在ISGF3基因表達的減弱,而黃芪注射液中、低劑量聯合恩替卡韋組可以使其表達恢復正常(較之空白對照組P0.05),恩替卡韋雖然也可以增強其表達,但是效果弱于聯合用藥組(較之空白對照組P0.05)。黃芪注射液聯合恩替卡韋對HepG2.2.15細胞炎性反應蛋白的影響。較之空白對照組,病毒對照組各蛋白表達除Caspase3差異無統(tǒng)計學意義(P0.05),其余蛋白的表達均上升明顯(P0.01)。較之病毒對照組,黃芪注射液低劑量聯合恩替卡韋組NF-κB下降(P0.05);恩替卡韋組、黃芪注射液中劑量聯合恩替卡韋組、黃芪注射液中、低劑量組OAS均下降(P0.05或P0.01);黃芪注射液低劑量聯合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組PKR下降(P0.05);余用藥組對NF-кB、OAS、PKR無影響(P0.05),各用藥組對Caspase3無影響(P0.05)。4.黃芪注射液聯合恩替卡韋治療刀豆蛋白(Con A)造成的NIH小鼠免疫性肝損傷實驗研究。較之正常對照組,模型組ALT升高了。較之模型組,黃芪注射液小劑量組以外各用藥組均能明顯降低小鼠ALT(P0.05)。較之恩替卡韋組,黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組和恩替卡韋對ALT的降低作用相當(P0.05),余有效用藥組效果更差(P0.01)。較之正常對照組,模型組SOD、MDA、NO均上升(P0.01)。較之模型組,各組均能降SOD(P0.01);除黃芪注射液小劑量組以外,各組均能降MDA(P0.01);各組均能降NO(P0.05或P0.01)。較之恩替卡韋組,各組降SOD作用小于恩替卡韋(P0.05或P0.01);各組降MDA作用黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組作用和恩替卡韋組相當(P0.05),余用藥組效果小于恩替卡韋(P0.01);各組降NO作用黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組和恩替卡韋組效果相當(P0.05),余用藥組效果小于恩替卡韋組(P0.05或P0.01)。較之正常對照組,模型組TNF-α和INF-γ均明顯升高(P0.01),較之模型組,恩替卡韋組(P0.01),及高、中劑量黃芪注射液聯合恩替卡韋組肝組織中的TNF-α顯著降低了(P0.05或P0.01),其余各組對TNF-α沒有顯著影響(P0.05)。較之恩替卡韋組,黃芪注射液高、中劑量聯合恩替卡韋組降TNF-α效果與恩替卡韋組相當(P0.05);各治療組均對INF-γ有顯著降低作用(P0.01),黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組效果和恩替卡韋組相當(P0.05),余用藥組效果比恩替卡韋組更差(P0.05或P0.01)。較之正常對照組,模型對照組NF-кB、OAS、PKR、Caspase3均升高(P0.01);較之模型對照組,恩替卡韋組NF-кB升高(P0.05),余用藥組無作用(P0.05);除黃芪注射液低劑量組和黃芪注射液中劑量聯合恩替卡韋組對OAS無影響(P0.05),余用藥組均降低了OAS(P0.05或P0.01);黃芪注射液中、低劑量聯合恩替卡韋組PKR升高(P0.05或P0.01),黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組PKR降低(P0.05),余用藥組PKR無變化(P0.05);各用藥組均對Caspase3無影響(P0.05)。肝臟系數,較之正常組,模型組肝臟系數明顯增高(P0.01);較之模型組,恩替卡韋組和黃芪注射液低劑量組較之模型組有明顯的增高(P0.01),黃芪注射液中劑量組和黃芪注射液低劑量聯合恩替卡韋組沒有變化(P0.05),黃芪注射液高、中劑量聯合恩替卡韋組、黃芪注射液高劑量組有顯著的降低作用(P0.01);較之正常組,經黃芪注射液高劑量聯合恩替卡韋組治療后肝臟系數幾乎沒有變化(P0.05)。脾臟系數,較之正常組,模型組脾臟系數明顯增高(P0.01);較之模型組,恩替卡韋和黃芪注射液低劑量組有明顯的增高(P0.01),黃芪注射液中劑量組和黃芪注射液低劑量聯合恩替卡韋組沒有變化(P0.05),黃芪注射液高、中劑量聯合恩替卡韋組和黃芪注射液高劑量組有顯著的降低作用(P0.01或P0.05)。胸腺系數,較之正常組,模型組胸腺系數明顯降低(P0.01);較之模型組,恩替卡韋和黃芪注射液低劑量組有明顯的降低(P0.01),黃芪注射液中劑量組沒有變化(P0.05),聯合用藥組和黃芪注射液高劑量組可以明顯升高胸腺系(P0.01)。肝臟病理切片,各用藥組和正常組相比較,存在著組織的病理損傷(P0.01),各用藥組和模型組相比,病理損傷減輕(P0.01)。結論:黃芪注射液聯合恩替卡韋具有很好的抗乙型肝炎病毒感染的作用,其療效優(yōu)勢在于不僅可以很好的抑制乙型肝炎病毒的復制,而且可以在停藥后延緩乙型肝炎病毒的反彈。有關的作用機理包括調節(jié)JAK-STAT通路m RNA表達和免疫應答所產生的抗病毒細胞因子和蛋白。黃芪注射液聯合恩替卡韋對免疫性肝損傷有較好的降谷丙轉氨酶、炎性反因子、炎性反應蛋白及保護肝細胞作用,總體來說,其抗病毒、護肝、調節(jié)免疫反應的綜合療效較之單獨使用這兩種藥物要好。黃芪注射液聯合使用或單獨使用,抗病毒和免疫調節(jié)的療效均呈劑量依賴性,實驗證實,高、中劑量的黃芪注射液使用抗病毒總體效果較好,低劑量的黃芪注射液免疫激發(fā)作用更加突出。本實驗提示臨床使用黃芪注射液根據慢性乙型肝炎患者的病情需要靈活掌握使用濃度可控制藥效不同的發(fā)揮方向。兩藥物聯合使用可能比單獨使用恩替卡韋或黃芪注射液更加安全有效,其作用還有待臨床試驗的驗證。
【關鍵詞】：黃芪注射液 恩替卡韋 慢性乙型肝炎 乙型肝炎病毒 中醫(yī)中藥
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2015
【分類號】：R512.62
【目錄】：

• 摘要3-7
• ABSTRACT7-16
• 引言16-22
• 第一章 文獻研究22-35
• 第一節(jié) 乙型肝炎病毒及其感染22-25
• 一、乙型肝炎病毒分類22
• 二、乙型肝炎病毒形態(tài)結構與理化特征22-23
• 三、乙肝病毒血癥的自然史23-24
• 四、慢性乙型肝炎患者的機體免疫功能缺陷和免疫病理過程24-25
• 第二節(jié) 慢性乙型肝炎的治療25-32
• 一、慢性乙型肝炎的護肝治療25-26
• 二、慢性乙型肝炎的抗病毒治療26-29
• 三、慢性乙型肝炎的免疫調節(jié)治療29-30
• 四、慢性乙型肝炎的中醫(yī)藥治療30-32
• 第三節(jié) 慢性乙型肝炎體內外實驗模型32-35
• 一、鴨乙型肝炎動物模型32-33
• 二、免疫性肝損傷動物模型33-34
• 三、乙肝病毒感染細胞模型34-35
• 第二章 實驗技術路線圖35-39
• 第一節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究總路線圖35-36
• 第二節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染鴨動物模型體內實驗路線圖36-37
• 第三節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙肝病毒感染HepG2.2.15細胞體外實驗路線圖37-38
• 第四節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋治療NIH小鼠ConA免疫性肝損傷實驗路線圖38-39
• 第三章 實驗研究39-78
• 第一節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗鴨乙型肝炎病毒作用的實驗研究39-47
• 一、實驗材料39
• 二、實驗方法39-43
• 三、結果43-46
• 四、討論46-47
• 第二節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋對HepG2.2.15細胞HBVDNA的抑制作用47-53
• 一、實驗材料47-48
• 二、實驗方法48-51
• 三、結果51-52
• 四、討論52-53
• 第三節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究之一藥物對HepG2和HepG2.2.15細胞JAK-STAT通路mRNA的影響53-60
• 一、實驗材料53-55
• 二、實驗方法55-57
• 三、結果57-58
• 四、討論58-60
• 第四節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋抗乙型肝炎病毒感染機理研究之二藥物對HepG2.2.15細胞NF-ΚB、OAS、PKR、Caspase3四個蛋白表達的影響60-69
• 一、實驗材料60-61
• 二、實驗方法61-64
• 三、結果64-66
• 四、討論66-69
• 第五節(jié) 黃芪注射液聯合恩替卡韋治療ConA致NIH小鼠免疫性肝損傷的實驗研究69-78
• 一、實驗材料69
• 二、實驗方法69-70
• 三、結果70-75
• 四、討論75-78
• 結語78-79
• 參考文獻79-84
• 附錄84-94
• 在校期間論文發(fā)表情況94-95
• 致謝95

【參考文獻】

中國期刊全文數據庫 前7條

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本文編號：643135