本文關(guān)鍵詞：腸道上皮細(xì)胞來源的exosome在腸道免疫平衡維持中的功能及其機(jī)制研究

  更多相關(guān)文章： Exosomes 腸道免性疫耐受 炎癥腸病 TGF-β1

【摘要】：腸道是人體最大的免疫耐受器官,對大量的食物抗原和腸道菌群進(jìn)行耐受。然而,腸道免疫耐受的潛在機(jī)制至今仍然不是很清楚。一系列因素的相互作用形成了一個精細(xì)復(fù)雜的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò),調(diào)節(jié)腸道的免疫穩(wěn)態(tài),這些因素包括調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Regulatory T cell,Treg)、DC、CD8+T 細(xì)胞、yδT 細(xì)胞、調(diào)節(jié)性 B 細(xì)胞、IgA、腸道共生菌群和大量細(xì)胞因子如TGF-β1和IL-10。而一旦腸道免疫耐受被打破,就會導(dǎo)致腸道的自身免疫性疾病,如IBD。IBD是一種最常見的腸道免疫失衡性疾病之一。炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)又稱腸炎,是一組腸道炎癥性疾病的統(tǒng)稱。炎癥性腸病的主要分為克羅恩病和潰瘍性結(jié)腸炎兩類[18]。由于其具有反復(fù)發(fā)作的特性,IBD病人的病情控制并不樂觀,所以深入探討腸道免疫耐受對于研究治療IBD的新策略具有重要意義。Exosome是由活細(xì)胞分泌的、具有直至雙分子層、大小在50-100nm之間的生物活性小囊泡。它們是由胞內(nèi)的多囊泡體出芽、融合,再向胞外釋放。如今已有多項研究證實,exosome在免疫系統(tǒng)中扮演著多重角色,它既能抑制免疫反應(yīng)、又能正向促進(jìn)免疫反應(yīng)的發(fā)生。我們已經(jīng)知道,腸道上皮細(xì)胞能夠分泌MHC-Ⅱ+A33+exosome,而且在給大鼠喂食特定的抗原之后,其血清中會短暫地出現(xiàn)類似exosome的囊泡,人們將其命名為tolerosome。本課題旨在探究來自小鼠腸道的exosome是否參與了腸道免疫耐受的維持,同時以exosome為視角來解釋腸道免疫耐受的機(jī)制。首先我們將從腸道獲取的exosome進(jìn)行鑒定,我們的結(jié)果表明來自小腸的exosome(Exosomes from Small Intestine,Si-EXO)和大腸來源的 exosome(Large Intestine,Li-EXO)都是 MHC-Ⅱ、CD11c 和 A33 陽性的,說明腸道 exosome 主要是由腸道樹突狀細(xì)胞(Dendritic Cell,DC)和腸道上皮細(xì)胞(Intestinal Epithelial cell,IEC)分泌的。為了進(jìn)一步對提取的exosome進(jìn)行鑒定,我們采用了蔗糖密度梯度離心法進(jìn)行檢測,結(jié)果顯示,HSP70和A33這兩個蛋白質(zhì)集中在1.09-1.17g/ml 之間,提示 exosome 的密度在 1.09-1.17g/ml 之間。這兩種 exosome都高表達(dá)TGF-β 1,暗示其具有免疫抑制效應(yīng)。接下來我們在體外檢測了其免疫抑制的功能,結(jié)果表明這兩種exosome在體外都能夠抑制CD4+T細(xì)胞的增殖,而且是濃度梯度依賴的。為了區(qū)分具體是DC還是IEC來源的exosome發(fā)揮免疫抑制效應(yīng),我們用CD11c+磁珠分選出CD11c+和CD11c+ Li-EXO,并對這兩群exosome進(jìn)行鑒定。結(jié)果顯示腸道上皮細(xì)胞來源的Li-EXO發(fā)揮了免疫抑制效應(yīng)。為了證實TGF-β 1在A33+ Li-EXO的免疫抑制效應(yīng)中發(fā)揮的作用,我們預(yù)先用一種強(qiáng)效的、具有選擇性的TGF-β受體Ⅰ抑制劑SB525334處理CD4+T細(xì)胞,然后再和A33+Li-EXO進(jìn)行孵育。實驗結(jié)果顯示,在阻斷了 TGF-β 1信號通路之后,A33+Li-EXO對CD4+T細(xì)胞的增殖抑制效果完全消除了,由此說明A33+Li-EXO通過TGF-β 1信號抑制CD4+T細(xì)胞的增殖。我們采用DSS誘導(dǎo)小鼠炎癥性腸病(Inflammatory Bowel Disease,IBD)模型,研究分離出來的腸道exosome是否在體內(nèi)參與腸道免疫耐受。在給小鼠回輸A33+Li-EXO之后,我們觀察到隨著回輸A33+Li-EXO的濃度增加,小鼠體重減輕的趨勢得到了緩解。A33+ Li-EXO在體內(nèi)和體外都能夠誘導(dǎo)CD4+Foxp3+ Treg的分化。為了明確A33+Li-EXO在體內(nèi)通過誘導(dǎo)了 CD4+Foxp3+Treg而發(fā)揮緩解小鼠IBD,我們用Anti-CD25小鼠單抗在體內(nèi)部分敲除CD4+Foxp3+ Treg,結(jié)果顯示A33+Li-EXO緩解IBD的效果減弱了,說明Treg參與了 A33+Li-EXO緩解IBD的過程。此外,來自IBD小鼠的Li-EXO(IBD-Li-EXO)比健康小鼠的Li-EXO(Ctrl-Li-EXO)含有更高水平的TGF-p1。因此,無論在體內(nèi)還是體外,IBD-Li-EXO免疫抑制功能和緩解IBD方面都比Ctrl-Li-EXO更強(qiáng)。此外,我們還發(fā)現(xiàn)A33+Li-EXO能夠顯著地抑制LPS刺激DC后IL-12的分泌水平,同時在混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)中抑制了 T細(xì)胞的增殖,我們采用了 DC功能缺陷的CD11c-DTR小鼠建立IBD模型,經(jīng)A33+ Li-EXO處理后,注射白喉毒素的CD11c-DTR小鼠經(jīng)DSS誘導(dǎo)IBD后,其體重減輕的程度明顯比野生型的小鼠更高,更好地說明了A33+Li-EXO通過調(diào)節(jié)DC的功能緩解了小鼠IBD。而我們用中性鞘磷脂酶抑制劑Spiroepoxide在體內(nèi)抑制exosome的分泌之后,小鼠IBD癥狀加重,在經(jīng)過spiroepoxide處理的DSS誘導(dǎo)IBD小鼠上回輸外源性Li-EXO后,spiroepoxide增強(qiáng)小鼠對DSS誘導(dǎo)的IBD的易感性的效應(yīng)消失了。結(jié)果表明,Spiroepoxide能夠抑制小鼠腸道exosome的分泌,因而增強(qiáng)了小鼠對DSS誘導(dǎo)的IBD的易感性。此外,有趣的是,我們發(fā)現(xiàn),A33+ Li-EXO特異性地定居于腸道中,說明這群exosome只在腸道局部發(fā)揮作用。除了 Li-EXO,其他幾種器官來源的exosome都不表達(dá)A33,而且將外源性A33+ Li-EXO回輸?shù)襟w內(nèi)后大部分都停留在胃、小腸、大腸和腸系膜淋巴結(jié)等胃腸道組織中,這些結(jié)果表明A33+Li-EXO具有器官特異性,在胃腸道局部發(fā)揮作用。在本課題中,我們發(fā)現(xiàn)腸道上皮細(xì)胞分泌了具有免疫抑制效果的exosome,這些exosome能夠緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD,這些結(jié)果意味著腸道exosome參與了腸道免疫耐受的維持。我們的研究結(jié)果為解釋腸道免疫耐受提供了一種新的機(jī)制,同時,也提示增加腸道exosome的分泌可能對矯正腸道免疫平衡有積極的作用,為治療IBD等腸道免疫失衡疾病提供了新思路。
【關(guān)鍵詞】：Exosomes 腸道免性疫耐受 炎癥腸病 TGF-β1
【學(xué)位授予單位】：浙江大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R574
【目錄】：

• 致謝5-7
• 序言7-11
• 中文摘要11-14
• ABSTRACT14-18
• 縮略詞表18-23
• 1. 引言23-28
• 2. 材料與方法28-37
• 2.1. 實驗材料28-30
• 2.1.1. 實驗動物與細(xì)胞系28
• 2.1.2. 實驗試劑28-29
• 2.1.3. 主要溶液的配制29
• 2.1.4. 主要實驗儀器29-30
• 2.1.5. 引物序列30
• 2.2. 實驗方法30-37
• 2.2.1. Exosome的提取和鑒定30-31
• 2.2.2. Exosome的電鏡觀察31
• 2.2.3. Exosome的Western blot和流式分析31-32
• 2.2.4. T細(xì)胞增殖分析32
• 2.2.5. 大腸來源的exosome (Li-EXO)的純化分析32
• 2.2.6. CD4~+Foxp3~+Treg分析32-33
• 2.2.7. IBD小鼠模型的誘導(dǎo)和A33~+ Li-EXO處理33
• 2.2.8. DC功能檢測33-34
• 2.2.9. 組織病理學(xué)鑒定34
• 2.2.10. 體內(nèi)和體外exosomes分泌的抑制34-35
• 2.2.11. 共聚焦顯微鏡35
• 2.2.12. 小鼠基因型鑒定PCR方法35-36
• 2.2.13. 統(tǒng)計學(xué)處理36-37
• 3. 實驗結(jié)果37-87
• 3.1. 小鼠腸道能夠分泌高表達(dá)TGF-B1的EXOSOMES37-41
• 3.2. 來自腸道上皮細(xì)胞的LI-EXO在體外通過TGF-B1抑制了CD4~+T細(xì)胞的增殖41-51
• 3.3. A33~+ LI-EXO通過TGF-B1信號通路緩解了DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的癥狀51-59
• 3.4. A33~+LI-EXO通過誘導(dǎo)TREGS來緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的癥狀59-68
• 3.5. DC參與了A33~+LI-EXO緩解DSS誘導(dǎo)的小鼠IBD的過程68-74
• 3.6. 抑制體內(nèi)EXOSOMES的分泌會增加小鼠對DSS誘導(dǎo)的IBD的易感性74-79
• 3.7. A33~+LI-EXO特異地在胃腸道發(fā)揮作用79-87
• 4. 討論87-90
• 5. 結(jié)論90-96
• 參考文獻(xiàn)91-96
• 綜述: 腸道免疫耐受機(jī)制研究進(jìn)展96-110
• (綜述)參考文獻(xiàn)105-110
• 作者簡歷110

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