本文關(guān)鍵詞：仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)技術(shù)的研究

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【摘要】：研究背景：肝衰竭是臨床常見的嚴重肝病癥候群,病死率高達60%以上,雖然肝移植是目前治療肝衰竭的理想方法,但供體肝來源的嚴重缺乏和移植排斥等問題限制了其廣泛開展臨床應(yīng)用。生物人工肝是目前肝衰竭患者最有希望獲得較好療效的體外治療手段之一,它不僅為肝衰竭患者等待肝移植提供了過渡時間,并且還為可逆性肝衰竭患者恢復(fù)其肝功能,從而為避免肝移植提供了可能。目前生物人工肝研究的關(guān)鍵問題之一就是如何利用生物反應(yīng)器在肝細胞體外培養(yǎng)中長時間維持肝細胞表型和分化功能。體外培養(yǎng)細胞功能改善的一個重要原則就是模擬體內(nèi)細胞環(huán)境,由此,眾多研究學(xué)者提出體外肝細胞三維培養(yǎng)是解決上述問題的有效途徑。目前,國內(nèi)外基于生物人工肝生物反應(yīng)器肝細胞三維培養(yǎng)及其他能為之提供思路的體外肝細胞三維培養(yǎng)及肝組織構(gòu)建的研究非常多,如中空纖維三維培養(yǎng)、微載體三維培養(yǎng)、球形聚集三維培養(yǎng)、Cell sheets三維培養(yǎng)、快速成型三維培養(yǎng)等,但相關(guān)研究存在共性缺陷：即都只是讓肝細胞實現(xiàn)了在三維生長環(huán)境下生長培養(yǎng),在肝細胞與非實質(zhì)細胞共培養(yǎng)、肝細胞形成微結(jié)構(gòu)的有序仿生排列、細胞與細胞、細胞與細胞基質(zhì)間相互作用等肝細胞極性建立機制上都都存在諸多問題沒有解決,而且肝細胞功能活力也無法與肝細胞在體相比較。由于肝臟本身就是一個極佳的肝細胞培養(yǎng)反應(yīng)器,生長于肝臟中的肝細胞不僅達到了數(shù)量和密度上的要求,而且呈有序極性肝板排列。研究表明,肝細胞極性是肝臟獨特生理功能的基礎(chǔ)。鑒于上述肝細胞極性與功能的密切關(guān)系,仿生肝臟結(jié)構(gòu)的三維培養(yǎng)模式有望成為解決上述問題的有效途徑。而且體外肝細胞三維培養(yǎng)設(shè)計只有最大程度地接近正常肝臟內(nèi)肝細胞微環(huán)境及結(jié)構(gòu),能夠仿生“肝小葉”、“肝板”,同時,將這一理念與生物人工肝生物反應(yīng)器結(jié)合,實現(xiàn)生物反應(yīng)器的仿生組織工程化設(shè)計,才能最大程度維持肝細胞活力功能、分化表型。研究目的：本實驗研究正是基于微流控芯片三維培養(yǎng)技術(shù),通過借鑒肝細胞在肝臟的極性肝板排列,以及其與非實質(zhì)細胞、細胞外基質(zhì)相互作用的仿生學(xué)原理,提出仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)技術(shù)研究課題,認為仿肝板結(jié)構(gòu)三維培養(yǎng)有助于重建和維持肝細胞極性從而使肝細胞在體外培養(yǎng)中具備更接近于體內(nèi)細胞的表型和分化功能。本項目擬利用微流控芯片技術(shù)在體外構(gòu)建仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織,通過對這種培養(yǎng)模式下肝細胞功能進行測定并與其他體外培養(yǎng)模式相比較,以期得到新的適于生物人工肝應(yīng)用的體外肝細胞培養(yǎng)模式以及新型生物反應(yīng)器,為生物人工肝、肝組織工程、細胞移植治療、肝臟病理生理等進一步研究奠定基礎(chǔ)。實驗方法：1、設(shè)計、制作微流控芯片：經(jīng)過前期大量文獻調(diào)研、反復(fù)設(shè)計、驗證,確定芯片的制作工藝為傳統(tǒng)軟光刻和再鑄模技術(shù),制作材料為聚二甲硅氧烷(PDMS),以及芯片設(shè)計數(shù)據(jù),后期通過我們的合作方(中國科學(xué)院上海微系統(tǒng)與信息技術(shù)研究所)對芯片進行加工制作,最終完成芯片的制作。2、實驗用細胞、藻酸鹽水凝膠及膠原制備所需溶液準備、實驗組及對照組設(shè)計：①實驗用細胞準備：a.人肝細胞系：(1)C3A (2)HepGL (3)CL-1(LO2)b.人內(nèi)皮細胞系：EA.hy926c.細胞培養(yǎng)基：DMEM+10%FBS+1%雙抗②藻酸鹽水凝膠制備所需溶液準備(詳見正文部分)：③實驗組及對照組設(shè)計：實驗組：仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)(其中C3A:EA.hy926=3:1)對照組1：混合式三維共培養(yǎng)(其中C3A:EA.hy926=3:1)對照組2：混合式二維共培養(yǎng)(其中C3A:EA. hy926=3:1)每組設(shè)立4個復(fù)孔。3、仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)、混合式三維共培養(yǎng)、混合式二維共培養(yǎng)實驗具體操作(以C3A為例)：①實驗組(仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng))操作：將海藻酸鈉C3A及EA. hy926細胞溶液、緩沖液及膠凝液在微量注射泵的作用下持續(xù)通入微流控芯片內(nèi)。海藻酸鈉C3A細胞懸液、海藻酸鈉EA. hy926細胞懸液、緩沖液、膠凝液流速為20ul/min、 10ul/min、15ul/min、4ml/h(約66.7ul/min)。由于這四種液體流達到層流條件,當這幾種液體在主反應(yīng)通道交匯后,便開始形成包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠。形成水凝膠后,將其導(dǎo)入裝有培養(yǎng)基的TissueFlex(?) Microbioreactors內(nèi)進行三維動態(tài)灌注培養(yǎng)。其中,為摸索最佳流速條件,細胞是否形成肝板樣排列,我們采用不同顏色染料進行實驗分析,找出四種溶液通入微流控芯片的最佳方案及流速,然后再進行具體實驗驗證,采取活細胞雙熒光標記,激光共聚焦顯微鏡下即時觀察C3A和EA. hy926的肝板樣位置排布；②對照組1(混合式三維共培養(yǎng))操作：將C3A和EA. hy926混合后通入芯片,其余步驟同實驗組(仿肝板有序三維共培養(yǎng))；③對照組2(混合式二維共培養(yǎng))操作：只需將兩種細胞混合后接種到TissueFlex(?) Microbioreactors中培養(yǎng)即可；待水凝膠內(nèi)形成穩(wěn)定的肝板結(jié)構(gòu)時,將水凝膠浸泡在藻酸鹽裂解酶液中,即可獲取仿肝板肝組織。4、對以上實驗組和對照組進行肝細胞活力、形態(tài)組織學(xué)、功能、基因表達水平等進行動態(tài)檢測：①形態(tài)結(jié)構(gòu)動態(tài)觀察：倒置顯微鏡下動態(tài)觀察；觀察時間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。②組織學(xué)形態(tài)觀察：雙免疫熒光；分別選取第5、7、10、13天來對仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織以及混合式三維培養(yǎng)下形成的肝組織形態(tài)進行觀察與鑒定。③活力動態(tài)檢測：CCK-8；檢測時間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。④功能動態(tài)檢測(蛋白質(zhì)檢測)：膽紅素、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白A1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、尿素、氨、CYP3A4、 CYP1A2、CYP2D6、安定、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受體、睪酮；檢測時間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。⑤基因表達水平動態(tài)檢測(RT-PCR):葡糖醛酸基轉(zhuǎn)移酶、葡萄糖激酶、葡萄糖-6-磷酸酶、白蛋白、轉(zhuǎn)鐵蛋白、α1-抗胰蛋白酶、載脂蛋白A1、谷丙轉(zhuǎn)氨酶、谷草轉(zhuǎn)氨酶、乳酸脫氫酶、堿性磷酸酶、氨甲酰磷酸合成酶、谷氨酰胺合成酶、CYP3A4、CYP1A2、CYP2D6、谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶、凝血因子Ⅱ、凝血因子Ⅴ、凝血因子Ⅶ、孕激素X受體、肌動蛋白β(內(nèi)參)；檢測時間分別為第0、1、2、3、4、5、6、7、9、11、13天。5、收集數(shù)據(jù)、統(tǒng)計分析、得出結(jié)論：所有數(shù)據(jù)的統(tǒng)計學(xué)處理以均數(shù)±標準差表示,每組至少重復(fù)三次。組間差異通過one-way ANOVA檢驗,然后再做Turkey或Games-Howell post-hoc檢驗,所有統(tǒng)計分析均采用SPSS 13.0軟件進行。當P值0.05時,數(shù)據(jù)分析才有顯著性差異,即具有統(tǒng)計學(xué)意義。實驗結(jié)果：1、設(shè)計、制作微流控芯片：經(jīng)過大量文獻調(diào)研、反復(fù)設(shè)計、實驗驗證,我們所設(shè)計的微流控芯片可用于仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維構(gòu)建,芯片設(shè)計合理可行。2、仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織三維培養(yǎng)方法步驟：將培養(yǎng)好的3瓶182cm2培養(yǎng)瓶C3A細胞和2瓶182cm2及2瓶75cm2培養(yǎng)瓶EA. hy926細胞消化處理,分別可獲取6×107和4× 107細胞,然后將細胞混懸于海藻酸鈉溶液中,制備單細胞懸液。將海藻酸鈉C3A及EA.hy926細胞溶液、緩沖液及膠凝液通入微流控芯片內(nèi)。其中,先通入緩沖液,再通入海藻酸鈉C3A細胞溶液、海藻酸鈉EA.hy926細胞溶液,最后通入膠凝液。這四中液體通入芯片內(nèi)的速度分別為：海藻酸鈉C3A細胞溶液為20ul/min,海藻酸鈉EA. hy926細胞溶液為10 ul/min,緩沖液為15 ul/min,膠凝液為4ml/h(約66.7ul/min)。由于通入芯片內(nèi)的液體流可達到層流狀態(tài),即肝細胞溶液在芯片主反應(yīng)通道(成膠區(qū))的中間流動,內(nèi)皮細胞溶液在肝細胞溶液兩邊分布,然后內(nèi)皮細胞溶液外圍是緩沖液,最外邊的液體為膠凝液,肝細胞與內(nèi)皮細胞呈現(xiàn)肝板結(jié)構(gòu)樣排布,所以最終形成了包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠,水凝膠束平均直徑約為100um左右。3、不同顏色染料流體分析、及活細胞雙熒光標記驗證形成肝板樣結(jié)構(gòu)的細胞排布：通過應(yīng)用不同顏色染料進行流體分析,得出上述四種液體的流速條件滿足層流條件；進一步活細胞雙熒光標記結(jié)果顯示,我們制備出了包裹肝板結(jié)構(gòu)的水凝膠束,水凝膠束內(nèi)包裹著C3A細胞和EA. hy926細胞,其中C3A細胞在中間,約有2到3排,EA. hy926細胞位于C3A細胞兩側(cè),呈現(xiàn)肝板結(jié)構(gòu)排布。4、對以上實驗組和對照組進行肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)的動態(tài)觀察：仿肝板結(jié)構(gòu)三維共培養(yǎng)組中,肝細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng),并呈有序肝板結(jié)構(gòu)排列生長,培養(yǎng)初期,肝細胞與內(nèi)皮細胞會呈現(xiàn)出增值的趨勢,隨著細胞增值到一定數(shù)量,由于水凝膠的外包被束縛,肝細胞會逐漸與內(nèi)皮細胞融合成一體,形成一個微型肝組織條索,細胞增殖幾乎停滯,處于維持階段,細胞存活良好�；旌鲜饺S共培養(yǎng)組中,肝細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng),但呈無序混合排列生長,培養(yǎng)初期,肝細胞與內(nèi)皮細胞會呈現(xiàn)出增值的趨勢,隨著細胞增值到一定數(shù)量,由于水凝膠的外包被束縛,肝細胞會逐漸與內(nèi)皮細胞融合成一體,形成一個微型肝組織條索,細胞增殖幾乎停滯,處于維持階段,細胞存活良好,但細胞形態(tài)較仿肝板結(jié)構(gòu)三維共培養(yǎng)組略差�；旌鲜蕉S共培養(yǎng)組中,肝細胞與內(nèi)皮細胞共培養(yǎng),但呈無序混合排列生長,培養(yǎng)初期,肝細胞與內(nèi)皮細胞會呈現(xiàn)出增值的趨勢,隨著細胞增值到一定數(shù)量,細胞長滿,生長空間受限,細胞接觸抑制,隨著培養(yǎng)時間延長,細胞形態(tài)變差,趨向凋亡。實驗結(jié)論：運用我們所設(shè)計制作的微流控芯片、在反復(fù)摸索微流控條件及實驗驗證下,成功構(gòu)建了仿肝板結(jié)構(gòu)肝組織,并建立了相關(guān)技術(shù)體系,為體外肝細胞三維培養(yǎng)提供了一種新的培養(yǎng)模式,有望使肝細胞在體外培養(yǎng)中具備更接近于體內(nèi)細胞的表型和分化功能,同時也為后續(xù)實驗奠定了基礎(chǔ)。而且該研究采用的均為人源性細胞,所形成的研究成果將能更好地應(yīng)用于生物人工肝、細胞移植治療、藥物檢測與評價等臨床應(yīng)用研究之中。
【關(guān)鍵詞】：生物人工肝 生物反應(yīng)器 仿生學(xué) 三維培養(yǎng) 肝細胞極性
【學(xué)位授予單位】：南方醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號】：R575.3
【目錄】：

• 摘要3-9
• ABSTRACT9-16
• 前言16-23
• 材料與方法23-43
• 一、材料23-27
• 二、方法27-42
• 三、統(tǒng)計方法42-43
• 結(jié)果43-54
• 一、設(shè)計、制作微流控芯片43-44
• 二、實驗用細胞、藻酸鹽水凝膠所需溶液準備44
• 三、仿肝板結(jié)構(gòu)有序三維共培養(yǎng)、混合式三維共培養(yǎng)、混合式二維共培養(yǎng)實驗具體操作步驟44-49
• 四、對以上實驗組和對照組進行肝細胞形態(tài)結(jié)構(gòu)動態(tài)觀察49-54
• 討論54-58
• 全文總結(jié)58-59
• 參考文獻59-66
• 附錄：縮略語和中英文對照表66-67
• 攻讀碩士學(xué)位期間成果67-68
• 致謝68-71

【參考文獻】

中國碩士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫 前1條

1 周鵬程;微囊懸浮型流化床式生物人工肝治療急性肝衰竭豬的血清代謝組學(xué)研究[D];浙江大學(xué);2012年

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本文編號：574942