本文關(guān)鍵詞：建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型檢測(cè)乙型肝炎病毒表型耐藥

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【摘要】：目的1建立一種基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法,并評(píng)價(jià)該方法的應(yīng)用價(jià)值。2使用表型耐藥檢測(cè)技術(shù)對(duì)體外準(zhǔn)種群進(jìn)行耐藥分析,探討突變株比例不同的HBV準(zhǔn)種群的耐藥規(guī)律性。方法1建立基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法在入選CHB患者標(biāo)本中篩選出含HBV野生株及突變株的血清標(biāo)本各1例,并從中分離HBV DNA,使用全基因擴(kuò)增技術(shù)在體外大量擴(kuò)增HBV全基因組。利用Bsp Q I酶對(duì)真核表達(dá)載體p HY106以及包含HBV全基因組的p EASY-Blunt T載體進(jìn)行酶切消化,并經(jīng)連接、轉(zhuǎn)化等步驟從單克隆菌落中篩選出正確連接HBV全基因組的轉(zhuǎn)化子,構(gòu)建重組真核表達(dá)載體p HY-CL與p HY-ZJ。大量提取重組質(zhì)粒載體,并將上述兩組質(zhì)粒瞬時(shí)轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞中,細(xì)胞培養(yǎng)后檢測(cè)培養(yǎng)體系上清液中HBV DNA,以驗(yàn)證瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。以相同的轉(zhuǎn)染方法分別轉(zhuǎn)染兩組質(zhì)粒并在轉(zhuǎn)染后的培養(yǎng)體系中,添加拉米夫定溶液使體系終濃度分別達(dá)到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM,測(cè)定在各種藥物濃度下HBV DNA水平的改變并計(jì)算出IC50,以評(píng)價(jià)HBV野生株與突變株的藥物敏感性。2 HBV準(zhǔn)種群的表型耐藥檢測(cè)與耐藥規(guī)律性分析使用定點(diǎn)突變方法誘導(dǎo)野生型重組質(zhì)粒產(chǎn)生rt M204V點(diǎn)突變,將野生型質(zhì)粒和經(jīng)點(diǎn)突變的rt M204V突變型質(zhì)粒混合,突變型質(zhì)粒所占比例設(shè)定為0%、20%、40%、60%、80%、100%,以完成構(gòu)成體外逆轉(zhuǎn)錄酶區(qū)準(zhǔn)種群。不同比例組成的準(zhǔn)種群分別轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞中,檢測(cè)在各種藥物濃度下HBV DNA水平的改變,并計(jì)算出各準(zhǔn)種群的IC50。探討不同比例組成的HBV準(zhǔn)種群在體外表型耐藥的變化規(guī)律,評(píng)價(jià)表型耐藥檢測(cè)技術(shù)在HBV準(zhǔn)種群耐藥檢測(cè)領(lǐng)域的應(yīng)用價(jià)值。結(jié)果1成功建立了基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法在體外大量擴(kuò)增HBV全基因組,并與真核表達(dá)載體p HY106相連接。結(jié)果表明成功構(gòu)建了包含HBV野生株和突變株基因組的重組載體,且基因組序列與插入方向準(zhǔn)確無(wú)誤。將上述2種重組載體轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞后在培養(yǎng)體系上清液中可檢出高拷貝的HBV DNA,證實(shí)了瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的成功構(gòu)建。再次將野生型及突變型質(zhì)粒轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞中,在培養(yǎng)體系中添加不同濃度的LMV使得終濃度達(dá)到0μM、0.01μM、0.1μM、1μM、10μM、100μM,檢測(cè)相應(yīng)藥物濃度下HBV DNA水平,并計(jì)算IC50,結(jié)果顯示野生型和突變型質(zhì)粒的IC50分別為0.024μM與1.75μM,突變型質(zhì)粒的IC50較野生型增加了73倍,在體外達(dá)到耐藥水平。2 HBV準(zhǔn)種群的表型耐藥檢測(cè)成功使用定點(diǎn)突變技術(shù),對(duì)野生型重組質(zhì)粒進(jìn)行rt M204V點(diǎn)突變改造,結(jié)果能保證非RT區(qū)以外的剩余HBV基因組序列不發(fā)生任何改變。將突變型質(zhì)粒比例為0%、20%、40%、60%、80%、100%的體外準(zhǔn)種群轉(zhuǎn)染至Hep G2細(xì)胞中,IC50測(cè)定表明隨著突變株在準(zhǔn)種群內(nèi)所占比例增大,IC50值亦顯著增加,其中尤其以突變株占20%~40%的比例區(qū)間增加最為顯著,該區(qū)間的細(xì)化分組試驗(yàn)亦能驗(yàn)證了這一結(jié)論,并提示HBV耐藥性可在突變型比例達(dá)到25%~30%時(shí)形成。上述研究結(jié)果均揭示了HBV準(zhǔn)種群中的野生株和突變株的比例組成與耐藥發(fā)生相關(guān),突變株比例增高可引發(fā)耐藥,且準(zhǔn)種群形成耐藥的比例區(qū)間處于25%~30%的比例區(qū)間之內(nèi)。結(jié)論1成功建立瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型介導(dǎo)的表型耐藥檢測(cè)方法,該方法可直觀、準(zhǔn)確地反映HBV的耐藥情況以及其程度,可用于臨床耐藥的監(jiān)測(cè)以及耐藥規(guī)律性研究。2成功將表型耐藥檢測(cè)技術(shù)用于體外準(zhǔn)種群的耐藥分析,結(jié)果顯示準(zhǔn)種群內(nèi)的比例組成與耐藥發(fā)生密切相關(guān),突變型所占比例達(dá)到25%~30%時(shí)可能導(dǎo)致耐藥產(chǎn)生。
【關(guān)鍵詞】：乙型肝炎病毒 表型耐藥 突變 準(zhǔn)種
【學(xué)位授予單位】：福建醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2015
【分類號(hào)】：R512.62
【目錄】：

• 縮略詞表3-4
• 中文摘要4-7
• 英文摘要7-10
• 前言10-14
• 第一部分 建立基于瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的HBV表型耐藥檢測(cè)方法14-41
• 材料和方法14-28
• 1. 研究對(duì)象14-15
• 2. 主要試劑與儀器15-17
• 3. 方法17-28
• 結(jié)果28-37
• 1. HBV全基因組的擴(kuò)增.28
• 2. HBV全基因組的TA克隆28-30
• 3. 含 1.1 倍HBV全基因組重組載體的構(gòu)建.30-33
• 4. 瞬時(shí)轉(zhuǎn)染細(xì)胞模型的建立33-35
• 5. 表型耐藥檢測(cè)35-37
• 討論37-41
• 第二部分HBV突變株比例不同的準(zhǔn)種群耐藥規(guī)律性的研究41-56
• 材料和方法41-45
• 1. 研究對(duì)象41
• 2. 主要試劑與儀器41-43
• 3. 方法43-45
• 結(jié)果45-52
• 1. 定點(diǎn)突變構(gòu)建rtM204V重組質(zhì)粒45-46
• 2. 體外準(zhǔn)種群的表型耐藥檢測(cè)46-52
• 討論52-56
• 全文結(jié)論56-57
• 參考文獻(xiàn)57-61
• 綜述61-71
• 參考文獻(xiàn)67-71
• 致謝71

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