本文關(guān)鍵詞：SOCE相關(guān)蛋白在大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和作用

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【摘要】：背景:在非興奮性細(xì)胞,細(xì)胞外鈣離子最主要通過鈣池操縱的鈣通道(store-operated Ca2+channels,SOCs)進(jìn)入細(xì)胞內(nèi),從而參與多種細(xì)胞生命活動(dòng)的調(diào)節(jié),如細(xì)胞的增殖和凋亡,因?yàn)镾OCs通道在非興奮性細(xì)胞生理作用上的特殊性和重要性,近年來越來越受到研究關(guān)注。間質(zhì)相互作用因子1(stromal interaction molecule1,STIM1)是細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜上表達(dá)的蛋白,近年來經(jīng)大量的研究證明它與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)識(shí)別細(xì)胞內(nèi)鈣濃度有關(guān),鈣釋放激活鈣通道蛋白1(Calcium release-activated calcium channel protein1,Orai1)是細(xì)胞膜上眾多的鈣離子通道之一,STIM1與Orai1現(xiàn)在已經(jīng)被認(rèn)定為SOCs的兩個(gè)重要組成部分。重癥急性胰腺炎(severe acute pancreatitis,SAP)是常見急腹癥,胰腺炎的胰外器官損害很常見,其中又以急性肺損傷(acute lung injury of rats,ALI)發(fā)生最為常見。近年來大量研究都證實(shí)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷在急性肺損傷發(fā)病的過程中起關(guān)鍵作用。目的:研究大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中(store-operated calcium entry,SOCE)相關(guān)蛋白的變化及抑制soce的影響和lps刺激肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞后soce相關(guān)蛋白變化及rna干擾后的影響,探討soce相關(guān)蛋白在重癥急性胰腺炎肺損傷發(fā)病機(jī)制中的作用,為臨床治療和預(yù)防重癥急性胰腺炎肺損傷找到新的靶點(diǎn)。方法:實(shí)驗(yàn)一:健康雄性(spraghe-dawley,sd)大鼠30只,體重約200g,隨機(jī)分為3組:假手術(shù)組(con),2-apb治療組(2-apb+sap)和sap模型組(sap)。sap動(dòng)物模型采用1.5%的去氧膽酸鈉溶液(lml/kg)逆行胰膽管注射法。2-apb治療組造模前24小時(shí)按腹腔注射2-apb(2.5mg/kg)。假手術(shù)組僅開腹輕翻胰腺后即關(guān)腹。造模24h后,各組大鼠麻醉后開腹,腹主動(dòng)脈采血并取胰腺、肺組織。觀察胰腺和肺組織的大體病理改變,he染色法觀察肺組織及胰腺組織的病理改變,行胰腺和肺組織病理評(píng)分;取左肺組織,測(cè)定其干濕質(zhì)量,計(jì)算肺組織含水量;用全自動(dòng)血?dú)鈾z測(cè)儀進(jìn)行動(dòng)脈血?dú)夥治鰷y(cè)定,計(jì)算氧合指數(shù)(pao2/fio2);采用碘-淀粉比色法并對(duì)血淀粉酶的含量進(jìn)行測(cè)定;使用酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定法(elisa)檢測(cè)血清tnf-α和il-6水平;采用real-timepcr測(cè)定肺組織中orai1、stim1mrna的水平;采用蛋白印跡(westernblot)法檢測(cè)orai1、stim1蛋白在肺組織中的表達(dá)。實(shí)驗(yàn)二:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物、分組及造模方法同實(shí)驗(yàn)一。造模24h后,各組大鼠麻醉下開腹,取肺組織。采用免疫熒光法檢測(cè)肺微血管上皮細(xì)胞orai1、stim1蛋白的表達(dá);采用末端脫氧核甘酸轉(zhuǎn)移酶介導(dǎo)dutp缺口末端標(biāo)記方法(terminaldeoxynucleotidyltransferase-mediateddutp-biotinnick-endlabeling,tunel)檢測(cè)大鼠肺微血管上皮細(xì)胞凋亡的情況;應(yīng)用透射電鏡觀察大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化;采用real-timepcr檢測(cè)肺組織中bax、caspase3mrna的水平。實(shí)驗(yàn)三:由pricells公司購(gòu)進(jìn)的大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞系,經(jīng)復(fù)蘇、培養(yǎng)、傳代,于第五代開始用于實(shí)驗(yàn)。根據(jù)在genebank中檢索的大鼠stim1、orail基因序列,設(shè)計(jì)、合成3對(duì)針對(duì)大鼠stim1、orail基因的小干擾rna序列,應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞。培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,應(yīng)用negativecontrolfam小干擾rna序列轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞,48h后應(yīng)用免疫熒光法檢測(cè)小干擾rna序列轉(zhuǎn)染效率;培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞共分8組;mock組(只加陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000,不加小干擾rna序列);negativecontrol干擾組;stim1干擾組1;stim1干擾組2;stim1干擾組3;orail干擾組1;orail干擾組2;orail干擾組3。轉(zhuǎn)染48h,應(yīng)用real-timepcr方法驗(yàn)證其對(duì)stim1、orail表達(dá)抑制的有效性,挑選抑制效應(yīng)最強(qiáng)的小干擾rna序列進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。培養(yǎng)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞分為5組:空白對(duì)照組(blank),培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)72h;lps刺激組,培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h,加入lps(100ng/ml)繼續(xù)剌激24h;stim1干擾組:使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的sirna,轉(zhuǎn)染48h后,加入lps(100ng/ml)繼續(xù)剌激24h;orai1干擾組:使用陽(yáng)離子脂質(zhì)體2000轉(zhuǎn)染相應(yīng)的sirna,轉(zhuǎn)染48h后,加入lps(100ng/ml)繼續(xù)剌激24h;nfatc3抑制劑組,培養(yǎng)基持續(xù)培養(yǎng)48h,加入lps(100ng/ml)和inca-6(1.0um)繼續(xù)剌激24h。各組細(xì)胞用藥物作用24h后,以mtt檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞存活率;以tunel檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞凋亡比率;以westernblot檢測(cè)法檢測(cè)細(xì)胞stim1、orai1蛋白表達(dá)水平;以realtime-pcr法檢測(cè)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中stim1、orai1、nfatc3、bax和caspase3mrna的水平變化。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一:與con組相比,sap組胰、肺組織病理?yè)p傷明顯,病理評(píng)分增高;肺組織含水量升高,氧合指數(shù)降低;血清淀粉酶、tnf-α和il-6含量升高;肺組織中stim1和orai1mrna和蛋白表達(dá)水平明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與sap組相比,2-apb治療組的胰、肺病理?yè)p傷較輕,病理評(píng)分降低;肺組織含水量降低,氧合指數(shù)升高;血清淀粉酶、tnf-α和il-6含量降低;肺組織中stim1和orai1mrna和蛋白表達(dá)水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。實(shí)驗(yàn)二:與con組相比,sap組肺微血管上皮細(xì)胞orai1、stim1蛋白的表達(dá)明顯升高;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比率增加;肺組織中bax、caspase3mrna的水平明顯增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷明顯。與sap組相比,2-apb治療組的肺微血管上皮細(xì)胞orai1、stim1蛋白的表達(dá)明顯降低;肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡比率降低;肺組織中bax、caspase3mrna的水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05);肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)損傷減輕。實(shí)驗(yàn)三:免疫熒光檢測(cè)小干擾rna序列轉(zhuǎn)染效率約80%;篩選出針對(duì)大鼠stim1、orail的小干擾rna序列各一條,real-timepcr驗(yàn)證可有效抑制stim1、orailmrna轉(zhuǎn)錄水平,抑制效率在70%以上。與blank組比較,lps組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活率降低、凋亡比率升高;細(xì)胞中stim1、orai1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平升高,nfatc3、bax和caspase3mrna的水平增高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。與lps組比較,lps+stim1干擾組,lps+orai1干擾組,lps+inca-6組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞細(xì)胞存活率升高、凋亡比率降低;細(xì)胞中nfatc3、bax和caspase3mrna的水平降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(p0.05)。結(jié)論:1.采用膽胰管逆行注射去氧膽酸鈉制備sd大鼠急性胰腺炎肺損傷的模型,可以成功的模擬重癥急性胰腺炎并發(fā)急性肺損傷的癥狀。2.大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷過程中,肺組織stim1、orai1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平升高,應(yīng)用SOCE抑制劑2-APB后,STIM1、Orai1轉(zhuǎn)錄及表達(dá)水平下調(diào)且肺損傷指標(biāo)緩解,提示SOCE在急性胰腺炎肺損傷中發(fā)揮重要作用。3.SOCE參與急性胰腺炎肺損傷可能與調(diào)控肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡有關(guān)。4.SOC抑制劑的急性胰腺炎肺損傷的保護(hù)作用可能是通過抑制線粒體介導(dǎo)凋亡相關(guān)。5.LPS刺激可增高STIM1、Orail表達(dá),從而加重肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。6.針對(duì)STIM1及Orail的RNA干擾可能通過抑制STIM1-Orai1-CaN-NFAT信號(hào)通路,下調(diào)Bax、caspase3等因子的表達(dá)而減輕肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷。
【關(guān)鍵詞】：重癥急性胰腺炎 急性肺損傷 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 STIM1 Orai1 RNA干擾
【學(xué)位授予單位】：大連醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2016
【分類號(hào)】：R576
【目錄】：

• 中文摘要10-15
• 英文摘要15-18
• 第一部分 SOCE相關(guān)蛋白參與重癥急性胰腺炎誘導(dǎo)的急性肺損傷18-41
• 一、前言18-19
• 二、材料19-22
• （一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物19
• （二）主要儀器與設(shè)備19-20
• （三）試劑與藥品20-22
• 三、方法22-32
• （一）動(dòng)物模型的制備22
• （二）標(biāo)本采集方法22-23
• （三）各檢測(cè)指標(biāo)及方法23-32
• 1. 胰腺、肺組織病理觀察評(píng)分23
• 2. 血清淀粉酶含量測(cè)定23-24
• 3. 血清IL-6、TNF-ɑ 測(cè)定檢測(cè)24-25
• 4. 氧和指數(shù)測(cè)定25
• 5. 肺組織含水量測(cè)定25
• 6. 肺組織Orai1、STIM1 mRNA的檢測(cè)25-28
• 7. 肺組織Orai1、STIM1蛋白的檢測(cè)28-31
• 8. 統(tǒng)計(jì)方法31-32
• 四、結(jié)果32-36
• （一）SAP 大鼠模型制備后，大鼠一般情況和組織病理改變及病理評(píng)分32-33
• 1、各實(shí)驗(yàn)組大鼠造模 24h 后一般情況變化32
• 2、各實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺和肺組織觀察32
• 3、各實(shí)驗(yàn)組大鼠胰腺和肺組織光鏡下病理改變觀察32-33
• （二）各組大鼠血清淀粉酶含量的變化33
• （三）各組大鼠血清 IL-6、TNF-ɑ水平的變化33-34
• （四）各組大鼠氧和指數(shù)變化34
• （五）各組大鼠肺含水量變化34-35
• （六）Orai1、STIM1 m RNA 在肺組織中表達(dá)水平的變化35
• （七）肺組織中 Orai1 、STIM1 蛋白的檢測(cè)結(jié)果35-36
• 五、討論36-40
• 六、小結(jié)40-41
• 第二部分 抑制SOCE降低重癥急性胰腺炎肺損傷PMVEC凋亡41-58
• 一、前言41-42
• 二、材料42-44
• （一）實(shí)驗(yàn)動(dòng)物42
• （二）主要儀器與設(shè)備42-43
• （三）試劑與藥品43-44
• 三、方法44-51
• （一）動(dòng)物模型的制備44-45
• （二）標(biāo)本采集方法45
• （三）各檢測(cè)指標(biāo)及方法45-51
• 1. 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞orai1、STIM1蛋白表達(dá)45-46
• 2. 肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè)46-47
• 3.肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)觀察47-48
• 4. 肺組織Bax、caspase3mRNA的檢測(cè)48-50
• 5. 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法50-51
• 四、結(jié)果51-55
• （一）重癥急性胰腺炎大鼠模型制備后，，觀察大鼠一般情況和組織病理改變（同第一部分）51
• （二）肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 Orai1、STIM1 蛋白表達(dá)免疫熒光檢測(cè)51-52
• （三）肺微血管內(nèi)皮凋亡TUNEL檢測(cè)52-53
• （四）肺微血管內(nèi)皮超微結(jié)構(gòu)透射電鏡觀察53-54
• （五）Bax 和 caspase3 m RNA 在肺組織中表達(dá)水平的變化54-55
• 五、討論55-57
• 六、小結(jié)57-58
• 第三部分 SOCE相關(guān)蛋白R(shí)NA干擾對(duì)LPS刺激PMVECs的影響58-96
• 一、前言58-59
• 二、材料59-62
• （一）實(shí)驗(yàn)所需細(xì)胞器59
• （二）主要儀器與設(shè)備59-60
• （三）試劑與藥品60-61
• （四）配制試劑61-62
• 三、方法62-74
• （一）設(shè)計(jì)合成針對(duì)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞的 STIM1 和 Orail 基因的 RNA 干擾序列62
• （二）肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞培養(yǎng)62-64
• 1. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞復(fù)蘇62
• 2. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞傳代62-63
• 3. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞凍存63
• 4. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞計(jì)數(shù)63-64
• 5. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞刺激64
• （三）應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體 2000 介導(dǎo)大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 STIM1 和 Orail 基因的 RNA 干擾序列的轉(zhuǎn)染64-65
• 1. 大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞準(zhǔn)備64
• 2.配制大鼠肺微血管內(nèi)皮胞 RNA 干擾序列與陽(yáng)離子脂質(zhì)體 2000 復(fù)合物64-65
• 3.RNA 干擾序列轉(zhuǎn)染大鼠肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞65
• （四）Real-time PCR檢測(cè)RNA干擾抑制效率65-68
• （五）大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞實(shí)驗(yàn)分組68-69
• （六）MTT 實(shí)驗(yàn)檢測(cè) RNA 干擾對(duì) LPS 誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響69
• （七）Real-time PCR 法測(cè)定 Orai1，STIM1，NFATC3，Bax 和 caspase3 轉(zhuǎn)錄的水平69-70
• （八）肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞Orai1、STIM1蛋白的檢測(cè)70-73
• （九）肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡的檢測(cè)73-74
• （十）統(tǒng)計(jì)學(xué)方法74
• 四、結(jié)果74-79
• （一）RNA 干擾序列轉(zhuǎn)染大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的效率檢測(cè)74-75
• （二）RNA 干擾序列轉(zhuǎn)染大鼠微血管內(nèi)皮細(xì)胞后對(duì)相應(yīng)基因轉(zhuǎn)錄的抑制檢測(cè)75-76
• （三）STIM1 及 Orail 的 RNA 干擾對(duì) LPS 誘導(dǎo)肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷的影響76
• （四）Real-time PCR 檢測(cè)各組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 STIM1、Orail、NFAc3 、Bax 和 caspase3 轉(zhuǎn)錄的水平76-78
• （五）Western blot 檢測(cè)各組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞 STIM1、Orail 表達(dá)的水平78
• （六）TUNEL 檢測(cè)各組肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡水平78-79
• 五、討論79-84
• 六、小結(jié)84-85
• 參考文獻(xiàn)85-96
• 綜述96-106
• 參考文獻(xiàn)102-106
• 攻讀學(xué)位期間發(fā)表文章情況106-107
• 致謝107-108

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中國(guó)博士學(xué)位論文全文數(shù)據(jù)庫(kù) 前1條

1 王冠宇;SOCE相關(guān)蛋白在大鼠重癥急性胰腺炎肺損傷肺微血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)和作用[D];大連醫(yī)科大學(xué);2016年

本文編號(hào)：559813